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1分子レベルでの蛋白機能評価を行うことにより従来の多分子系での平均値の計測では得られない蛋白個々の分子の動的な挙動を観察することができる。従来の装置および標的蛋白の調製方法の改良をさらに目指した。標的蛋白の化学修飾では種々の問題が生じるので、GFP(緑色蛍光蛋白)を蛍光タグとして利用することを考えた。この系は試験管内で合成できるだけでなく、培養細胞や生体内で発現させた場合でもアッセイできる。この特長を生かせば、モーター蛋白にとどまらず、細胞内のシグナル伝達の分子メカニズムの可視化など応用範囲は広いと考えられる。
この2年間の研究結果として、以下の研究成果をあげた。
(1)組換え体蛋白の試験管内合成系の開発
大腸菌、パキュロウイルスなど従来の遺伝子工学的手法を用いた発現系では機能を保ったまま得ることが困難な骨格筋のミオシン蛋白をGFPとのキメラ蛋白として試験管内合成させ、ATPのターンオーバーという1分子レベルでの機能評価を行うことに成功した
(2)GFP並びにその変異体の1分子の同定
GFP以外にも蛍光特性を有する他の蛍光蛋白(緑色蛍光蛋白変異体 EYFP、イソギンチャク赤色蛍光蛋白 DsRed)についても検討を加え、全反射顕微鏡を用いて1分子レベルでイメージング出来た。
(3)FRET(蛍光エネルギー移動法)による蛋白分子間相互作用測定法の開発
DNAGyraseB2量体間の分子間相互作用を蛍光蛋白タグを用いて観察した。すなわち抗生物質Coumermycinをリンカーとして用い、溶液中でのGyrB-CFPとGyrB-YFP、あるいはGyrB-GFPとGyrB-DsRedを2量体化させるとFRETが観察された。
以上のように、GFPとその変異体は1分子レベル観察の分子タグとして有用であることが判明した。この技術の応用により蛋白の動的挙動も1分子レベルで観察出来るものと期待している。
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