1999 年度実績報告書

受精の瞬間に活性化されるプロテインキナーゼのクローニングと機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	10680653
研究機関	神戸大学
研究代表者	深見泰夫神戸大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (00156746)
研究分担者	佐藤賢一神戸大学, 遺伝子実験施設, 助手 (30235337)
キーワード	受精 / 胚発生 / ジグナル伝達 / 蛋白質リン酸化 / チロシンキナーゼ / ホスホリパーゼCγ / カルシウムシグナル
研究概要	アフリカツメガエル(ゼノパス)卵において、受精の瞬間に活性化されるチロシン特異的プロテインキナーゼ(以下Xykと略)のクローニングと機能解析のための実験を行い、以下の新しい知見を得た。 1.前年度に引き続き、部分アミノ酸配列の解読・cDNAクローニングを目的としたXyk精製を行った。これまでゼノパス約千匹分の卵からのXyk精製を終了し、現在その部分断片化およびアミノ酸配列の解読を急いでいるところである。 2.受精時にチロシンリン酸化を受けるXyk以外の卵タンパク質の同定を行い、アダプター分子Shcと膜脂質分解酵素であるホスホリパーゼCγ(PLCγ)を見いだした。前年度報告したように、チロシンキナーゼ阻害剤を注入したゼノパス卵では受精による卵の賦活が起こらないが、ShcとPLCγのチロシンリン酸化も阻害剤注入卵では抑えられていた。PLCγについてはさらに、(1)受精に伴いXykと結合し、チロシンリン酸化依存的に酸素活性が上昇すること、(2)PLC阻害剤の卵内注入により受精依存的卵内Ca2+濃度上昇や卵賦活の阻止が起こること、等が見いだされた。以上の結果はゼノパス卵の受精/賦活にXyk→PLCγ経路が必要であることを示唆している。 3.チロシンリン酸化を起こすストレス因子の一つである過酸化水素が、ゼノパス卵に対してXyk活性化/PLCγチロシンリン酸化/細胞内Ca2+濃度の上昇といった卵賦活様の効果を持つことを見いだした。この結果はXykの活性化がゼノパス卵賦活に十分である可能性を示唆している。 4.受精および過酸化水素によるゼノパス卵のタンパク質チロシンリン酸化をパラフォルムアルデヒド固定卵の凍結切片を用いた間接蛍光抗体法により解析した。その結果、いずれのリン酸化反応も卵の動物極側表層で起こることが見いだされた。この結果は、ゼノパス卵において受精の場が動物極に限られることとの関連で興味深い。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Sato,K.-I.et al.: "Evidence for the involvement of a Src-related tyrosine kinase in Xenopus egg activation"Dev.Biol. 209. 308-320 (1999)
[文献書誌] Fukami,Y.et al.: "Peptide inhibitors of MAPK pathway;A structure-mimetic peptide corre-sponding to the conserved IDA (Inter-DFG-APE)region of the kinase domain"Pharmacol.Ther.. 82. 399-407 (1999)
[文献書誌] Aoto,M.et al.: "A 58-kDa Shc protein is present in Xenopus eggs and is phosphorylated on tyrosine residues upon egg activation"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 258. 265-270 (1999)
[文献書誌] Nakazawa.M.et al.: "Biochemical analysis of the interaction between elongation factor 1α and α/β tubulins from a ciliate,Tetrahymena pyriformis"FEBS Lett.. 435. 29-34 (1999)
[文献書誌] Tokmakov,A.et al.: "Deregulation of MAPK at low pH due to a structural rearrangement of activation segment"Biochim.Biophys.Acta. 1476. 66-74 (2000)
[文献書誌] Sato K.-I.et al.: "Fertilization signalling and protein-tyrosine kinases"Comp.Biochem.physiol.. (in press). (2000)

1999 年度 実績報告書

受精の瞬間に活性化されるプロテインキナーゼのクローニングと機能解析

研究代表者

深見 泰夫 神戸大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (00156746)

研究成果

[文献書誌] Sato,K.-I.et al.: "Evidence for the involvement of a Src-related tyrosine kinase in Xenopus egg activation"Dev.Biol. 209. 308-320 (1999)

[文献書誌] Fukami,Y.et al.: "Peptide inhibitors of MAPK pathway;A structure-mimetic peptide corre-sponding to the conserved IDA (Inter-DFG-APE)region of the kinase domain"Pharmacol.Ther.. 82. 399-407 (1999)

[文献書誌] Aoto,M.et al.: "A 58-kDa Shc protein is present in Xenopus eggs and is phosphorylated on tyrosine residues upon egg activation"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 258. 265-270 (1999)

[文献書誌] Nakazawa.M.et al.: "Biochemical analysis of the interaction between elongation factor 1α and α/β tubulins from a ciliate,Tetrahymena pyriformis"FEBS Lett.. 435. 29-34 (1999)

[文献書誌] Tokmakov,A.et al.: "Deregulation of MAPK at low pH due to a structural rearrangement of activation segment"Biochim.Biophys.Acta. 1476. 66-74 (2000)

[文献書誌] Sato K.-I.et al.: "Fertilization signalling and protein-tyrosine kinases"Comp.Biochem.physiol.. (in press). (2000)

1999 年度実績報告書

深見泰夫神戸大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (00156746)