メダカ背腹構造突然変異Da遺伝子のマッピングとクローニング

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10680686
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 尾里 健二郎 名古屋大学, 生物分子応答研究センター, 教授 (90026790)
• 研究分担者: 木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
• キーワード: メダカ / 形態形式 / 背腹軸 / ポジショナルクローニング

研究概要

脊椎動物における背腹構造の形成機構は発生学上の焦点の一つである。メダカDa(double and fin)変異体は胴部、尾部において背側が腹側化している表現型を示す突然変異体である。本研究ではDa変異体原因遺伝子のポジショナルクローニング単離を試みた。
1)メダカ遺伝子連鎖地図を作成とDa遺伝子のマッピング:
メダカ遺伝子的連鎖地図を作成したところDa遺伝子は連鎖群VIIIにマップされた。Da遺伝子を挟む形で両側に存在する最も近いマーカーとDa遺伝子との物理的距離は144kb、及び360kbであった。これは染色体歩行を開始するにあたり十分近い距離であると考えられた。
2)整列化コスミドライブラリーの作成:Da遺伝子近傍のマーカーから染色体歩行を開始し、物理的地図を作成するために、HNI系統を利用してメダカコスミドライブラリーを作成した。平均インサート長40.2kbのものが約12万クローン(メダカハブロイド6ゲノム分に相当)384穴マイクロタイタープレート上に整列化した。これらをスクリーニングしてDa遺伝子近傍の2個のマーカーを含むコスミドクローンを得ることに成功した。
3)Da遺伝子近傍の物理的地図の作成:このコスミドクローンをプローグとして、メダカ間期核に対してFISHを行い、これらのマーカーが物理的にも近接して存在していることを顕微鏡下で明らかにした。
そこで、これら2個のマーカーから染色体歩行を開始し、BACクローンとコスミドクローンを用いて、Da遺伝子を完全にカバーするコンティグマップを完成させ、Da変異を含む最小領域の決定を行った。その結果、70〜250kbの範囲内にDa変異が含まれていることが明らかになった。これによってDa遺伝子は、1個のBACクローンでカバーされることが期待された。

研究成果

• [文献書誌] Hamada,K.: "Usefulness of the medaka B-actin promoter investigated using a mutant GFP reporter gene in transgenic medaka (Oryzias latipes)."Mol Marine Biol Biotech. 7・3. 173-180 (1998)
• [文献書誌] Niwa,K.: "Transplantation of blastula nuclei to non-enucleated eggs in the medaka,oryzias latipes."Develop Growth Differ. 41・2. 163-172 (1999)
• [文献書誌] Sasado,T.: "Expression of murine early embryonic antigens, SSEA-1 and antigenic determinant of EMA-1, in embryos and ovarian follides of a teleost medaka (Oryzias latipes)"Develop Growth Differ. 41・3. 293-302 (1999)
• [文献書誌] Ohtsuka,M,: "Construction of a Linkage Map of the Medaka (Oryzias latipes) and Mapping of the Da Mutant Locus Defective in Dorsoventral Patterning"Grenome Res.. 9. 1277-1287 (1999)