1998 年度実績報告書

過酸化脂質をターゲットとしたホスホリパーゼA_2のタンパク質工学的解析と応用

研究課題

研究課題/領域番号	10760042
研究機関	東北大学
研究代表者	小川智久東北大学, 農学部, 助教授 (80240901)
キーワード	ホスホリパーゼA_2 / 過酸化脂質 / タンパク質工学
研究概要	本研究計画では、ハブ毒腺ホスホリパーゼA2(PLA2)の基質結合部位のアミノ酸残基をタンパク質工学的に変異させ、基質特異性に関する構造-機能相関を明らかにし、これをもとに過酸化脂質特異的なPLA2を作出することを目的とする。本年度は、PLA2変異体のデザインとその調製を主に行った。67位Asn残基をSer,Gly,Lys,Aspへと置換したPLA2変異体については、Ser置換体は卵黄ホスファチジルコリンミセルリン脂質および卵黄ホスファチジルグリセロールミセルリン脂質に対していずれも活性が弱く(20分の1以下)、Gly置換体は卵黄ホスファチジルコリンミセルリン脂質に対しては活性が弱くなっていたが(50分の1)卵黄ホスファチジルグリセロールミセルリン脂質に対しては変わらなかった。他の変異体は変わらなかった。高度不飽和脂肪酸であるアラキドン酸を2位に含むホスファチジルコリンミセルリン脂質に対しては、Ser置換体が活性を保持していたが、他の変異体は活性が弱くなっていた(20〜50%)。したがって、67位Ser置換体にアラキドン酸に対する特異性の増強がみられた。一方、リン脂質認識部位の一部である54位から71位についてランダムに変異を導入するために先ず、PLA2の52〜53位部分に制限酵素MunI siteおよび81〜82位に相当する部分に制限酵素ScaI siteをそれぞれ導入した。部位特異的変異は、PCR法により行った。MunIおよびScaI制限酵素での切断により、カセット法でランダムに変異を導入するためのベクターを構築した。54位から71位に相当するフラグメントDNAは、MunIおよびScaIを含みさらに66位のCys残基を保存する形で合成した。Ligation反応後、大腸菌JM109株に形質転換した。PLA2変異体の効率的大量発現のために、リフォールデイング反応の際、限外濃縮器とリザーバーを組み合わせた方法で行い、これまでの2〜3倍の効率で行うことができた。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] M.Ohno,R.Menez,T.Ogawa et al.: "Molecular Evolution of Snake Toxins:Is th Functional Diversity of Snake Tokins Associated with a Mechanism of Accelecated Evolution?" Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 59. 309-364 (1998)
[文献書誌] I.Nobuhisa,T.Ogawa et al.: "Retrotransposable CRI-like elements in Crotalinae snake genanes" Toxicon. 36(6). 915-920 (1998)
[文献書誌] H.Tateno,A.Saneyoshi,T.Ogawa et al.: "Isolation and Characterization of Rhamnose-binding Lectins from Eggs of Stealhead Trout (Onconhynchusmykiss)" The Journal of Biological Chemistry. 273(30). 19190-19197 (1998)
[文献書誌] K.Muramoto,D.Kagawa,T.Sato,T.Ogawa et al.: "Functional and Structural characterization of multiple galectins from the skin mucus of congereel,Congermyriaster" Comparative Biochemistry and Physiology. (in press). (1999)
[文献書誌] T.Ogawa et al.: "Accelerated Evolution in the Protein-coding Region of Galectin cDNA,Congerin I and Congerin II,from skin Mucus of Conger EeL (conger Myriaster)" Bioscience Biotechnology and Biochemistry. (in press). (1999)
[文献書誌] 小川智久: "21世紀の栄養食とタンパク質の進化" 日本食品出版社, 10 (1999)

1998 年度 実績報告書

過酸化脂質をターゲットとしたホスホリパーゼA_2のタンパク質工学的解析と応用

研究代表者

小川 智久 東北大学, 農学部, 助教授 (80240901)

研究成果

[文献書誌] M.Ohno,R.Menez,T.Ogawa et al.: "Molecular Evolution of Snake Toxins:Is th Functional Diversity of Snake Tokins Associated with a Mechanism of Accelecated Evolution?" Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 59. 309-364 (1998)

[文献書誌] I.Nobuhisa,T.Ogawa et al.: "Retrotransposable CRI-like elements in Crotalinae snake genanes" Toxicon. 36(6). 915-920 (1998)

[文献書誌] H.Tateno,A.Saneyoshi,T.Ogawa et al.: "Isolation and Characterization of Rhamnose-binding Lectins from Eggs of Stealhead Trout (Onconhynchusmykiss)" The Journal of Biological Chemistry. 273(30). 19190-19197 (1998)

[文献書誌] K.Muramoto,D.Kagawa,T.Sato,T.Ogawa et al.: "Functional and Structural characterization of multiple galectins from the skin mucus of congereel,Congermyriaster" Comparative Biochemistry and Physiology. (in press). (1999)

[文献書誌] T.Ogawa et al.: "Accelerated Evolution in the Protein-coding Region of Galectin cDNA,Congerin I and Congerin II,from skin Mucus of Conger EeL (conger Myriaster)" Bioscience Biotechnology and Biochemistry. (in press). (1999)

[文献書誌] 小川智久: "21世紀の栄養 食とタンパク質の進化" 日本食品出版社, 10 (1999)

1998 年度実績報告書

小川智久東北大学, 農学部, 助教授 (80240901)

[文献書誌] 小川智久: "21世紀の栄養食とタンパク質の進化" 日本食品出版社, 10 (1999)