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本研究の目的は、PHドメインの細胞内動態を直接リアルタイムに可視化することによって、ターゲット分子へのアンカリングがどの様に制御されるのかを明らかにし、その機能を解明することであったが、この目的でのうえでホスホリパーゼC(PしC)δのPHドメインを一つのモデルとした。PLCδPHドメインのアンカリングではPIP_2がターゲットとなるであろう想定されている。また、産物であるIP_3によりPLCδのアンカリングが動的に制御されている仮説がある。また、他のPHドメインについても同様な動的アンカリング制御があることは考えられる。しかし、このようなことが実際に細胞内で起きているかは実際に確かめられていない。本年度は、PLCδのPHドメインについて以下の実験を行った。PHドメインを大腸菌でリコンビナント蛋白質として発現したものを蛍光標識したものを作製した。蛍光標識体を得るため、PLCδのPHドメインをリコンビナント蛋白として大腸菌で発現したものを分離、精製した。これをacrylodan、dapoxyl-bromoacetamideで標識することによって、蛍光色素標識体を作製した。これら蛍光ラベル対はIP3を加えることによってその蛍光強度が変化する事がわかった。このことからPHドメインがIP3を高親和性に結合できること、結合によってコンフォメーション変化が生ずることが明らかになった。また、PHドメインがPIP2に結合することがsuraface plasmon resonanceアッセイによって確かめられた。従って、蛍光標識PHドメインが細胞内でどのような挙動をするかを解析することが可能であることが示唆された。
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