キサンチン酸化酵素における非ヘム鉄の機能に関する研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10770054
• 研究機関: 日本医科大学
• 研究代表者: 岡本 研 日本医科大学, 医学部, 助手 (60267143)
• キーワード: キサンチン脱水素酵素 / キサンチン酸化酵素 / 鉄硫黄中心

研究概要

キサンチン脱水素酵素の鉄硫黄中心のリガンドと考えられるシステイン残基をセリンへと変換した組み換えウイルス数種の作製に成功した。すでに構築されている昆虫細胞発現系を用いて変異酵素の発現を行った。さらに大腸菌による発現酵素を得るための試みとして、ドメインごとの発現系の構築を行い、解析を行っている。
得られた数種の変異酵素について精製法を確立し、数ミリグラムの精製標品を得るに至った。これらの精製した変異酵素についてEPRスペクトルの測定を行った。2種の変異酵素とも2種の鉄硫黄中心センターに由来するシグナルが認められ、システインに替わってセリンがリガンドとなっていることが推測された。このEPR測定によって2個の鉄硫黄中心それぞれを形成するモチーフが推定できた。さらにカナダ、トロント大との共同研究により本酵素のX線結晶構造が明らかにされ、本研究の結果と併せて各々の鉄硫黄中心の立体構造上の位置、他の補酵素のと距離が明らかになった。このことより、酵素活性における分子内電子伝達の経路、FADの反応性に対する鉄硫黄中心の関与、活性酸素生成のメカニズムについて重要な知見が得られた。
現在はこれらの変異酵素について酸化還元滴定、種々の基質を用いた活性測定など、更なる解析を行っている。

研究成果

• [文献書誌] K. Ichimori, M. Fukahori, H. Nakazawa, K. Okamoto and T. Nishino: "Inhibition of xanthine oxdase and xanthine dehydrogenase by nitric oxide; nitric oxide converts reduced xanthine oxidizing enzymes into the desulfo-type inactive form."J. Biol. Chem.. 274. 7763-7768 (1999)
• [文献書誌] T. Iwasaki, K. Okamoto, T. Nishino, J. Mizushima, H. Hori, and T. Nishino: "Sequence Motif-specific Assignment of Two[2Fe-2S] Clusters in Rat Xanthine Oxidoreductase by Site-derected Mutagenesis"J. Bichem.. (in press).
• [文献書誌] C. Enroth, B.T.Eger, E.F. Pai, K. Okamoto, T. Iwasaki, T. Nishino, and T. Nishino: "Favins and Flavoproteins(S. Ghisla et al, eds.): Crystal structure of xanthine oxidoreductase and EPR assignment of Fe/S center."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIENTIFIC PUBLICATIONS. 4 (1999)
• [文献書誌] T. Nishino, K. Okamoto, H. Hori, A. Kounosu, T. Nishino: "Favins and Flavoproteins(S. Ghisla et al, eds.): The Mechanism of Conversion from Xanthine Dehydrogenase to Oxidase of Rat Enzyme Studied by Site-Directed Mutagenesis."RUDOLF WEBER AGENCY FOR SCIENTIFIC PUBLICATIONS. 4 (1999)