アデソ随伴ウイルスのRep蛋白質の変異導入による機能解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10770134
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 卜部 匡司 自治医科大学, 医学部, 助手 (40213516)
• キーワード: アデノ随伴ウイルス / Rep蛋白質 / 部位特異的組込み / アラニンスキャンニング変異導入

研究概要

アデノ随伴ウイルス(AAV)のゲノムは19番染色体長腕のAAVS1領域(19.q13.3-qter)に特異的に組み込まれる。この反応はウイルスの非構造蛋白質Repがウイルスゲノムの両端にあるinverted terminal repeat(ITR)上のGAGCモチーフとAAVS1のGAGCモチーフ様配列を認識することにより進行する。Rep蛋白質はまた、ウイルスゲノムの複製、ウイルス蛋白質の発現をも調節する多機能な蛋白質であるため詳細な解析が遅れている。そこで今回、系統的にRep蛋白質の機能ドメインを明らかにするため、部位特異的組込み活性を持つドメインが存在すると考えられているN末端約半分の領域のすべての塩基性、酸性アミノ酸を1、または2個ずつアラニンに変換した変異Repを作製し、GAGCモチーフへの結合能、ニッキング活性、AAVS1特異的組込み活性を各々、ゲルシフト法、in vitroアッセイ、PCR法で解析し、野性型と比較検討した。GAGCモチーフへの結合活性はR107A、K136A、R138Aで完全に消失していた。E66、EK83、K101、R113、R185、E239を各々アラニンに変換したものでは、結合活性が減弱していた。結合活性が消失または減弱していたものの中でE66Aを除いてすべて部位特異的組込み活性が低下していた。このことは、GAGCモチーフへの結合が部位特異的組込みに必須であることを示している。また、Mgイオンが結合すると推定される90番目と92番目のヒスチジンを別々にアラニンに置換したものでは、GAGCモチーフへの結合活性は残存していたものの、ニッキング活性は消失していた。これらの結果は、多機能なRep蛋白質の機能ドメインの解析を進めて行く上で重要な知見と考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Fan,D.-S.: "Prevention of dopaminergic neuron death by adeno-associated virus vector-mediated GDNF gene transfer in rat mesencephalic cells in vitro." Neurosci.Lett.248. 61-64 (1998)
• [文献書誌] Fan,D.-S.: "Behavioral recovery in 6-OHDA-lesioned rats by cotransduction of striatum with tyrosine hydroxylase and aromatic l-amino acid decarboxylase genes using two separate AAV vectors." Hum.Gene Ther.9. 2527-2535 (1998)
• [文献書誌] Kodaira,H.: "Fas and mutant estrogen receptor chimeric gene:a novel suicide vector for tamoxifen-inducible apoptosis." Jpn.J.Cancer Res.89. 741-747 (1998)
• [文献書誌] Kokubun,M.: "Apoptosis-mediated regulation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor production by genetically engineered fibroblasts." Gene Ther.5. 923-929 (1998)
• [文献書誌] Maeda,Y.: "Efficient gene transfer into cardiac myocytes using adeno-associated virus(AAV)vectors." J.Mol.Cell.Cardiol.30. 1341-1348 (1998)
• [文献書誌] Ogasawara,Y.: "The use of heterologous promoter's for adeno-associated virus(AAV)protein expression in AAV vector production." Microbiol.Immunol.42. 177-185 (1998)
• [文献書誌] Ogasawara,Y.: "Efficient production of adeno-associated virus vectors using split-type helper plasmids." Jpn.J.Cancer Res.in press.
• [文献書誌] Ozawa,K.: "A novel selective amplifier gene for hematopoietic stem cell gene therapy." Cancer Res.Ther.Control. 7. 27-31 (1998)
• [文献書誌] Urabe,M.: "Charged-to-alanine scanning mutagenesis of the N-terminal half of adeno-associated virus type 2 Rep78 protein." J.Virol.in press.