| 研究概要 |
1. CTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者におけるMtPK遺伝子の異常解析
(1) CTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者から採血し、Lymphoprep^<TM>(NYCOMED)を用いてリンパ球を分離し、一部はEBウイルスで株化し、保存。
(2) 分離した患者リンパ球のペレットからEDTA-SDS法によりゲノムDNAを抽出。
(3) PCR法により、MtPK遺伝子のエクソンの全配列を増幅。
鋳型として(2)で抽出したゲノムDNA(1μg)をもちい、酵素はTaKaRa Taq(2.5u)、プライマーはGenome Data BaseのMtPK遺伝子塩基配列から、12エクソンをそれぞれを増幅するように決定し、(株)サワデーに委託して合成。
PCR反応は、すでに有していた、Gene Amp PCR system^<TM>(PERKINELMER)を使用。
それぞれのPCR産物の1/10量をエチジウムブロマイド入り1%アガロースゲル(SEAKEM,FMC)に泳動し、PCR産物の合成を確認。
(4) PCR産物の塩基配列の決定
自動シークエンサーはすでに有していたALF Express^<TM>DNA Sequencer(Amersherm)を使用。
シークエンス反応はThermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with7-deaza-dGTPを用い、キットのプロトコールに従った。
現在、シークエンス進行中であるが、現時点ではCTGリピート伸長のない筋強直性ジストロフィー患者のMtPK遺伝子に欠失、点変異の存在は検出されていない。
2. 筋強直性ジストロフィー患者におけるDMAHPの発現解析
(1) 抗ヒトDMAHP抗体を作成中。
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