PCR法を用いたスポロトリコーシスのDNA診断法の確立

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10770418
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 杉田 泰之 横浜市立大学, 医学部・附属病院, 講師 (30264617)
• キーワード: Sporothrix schencku / DNA診断 / PCR法 / プライマー / DNA抽出

研究概要

皮膚の深在性真菌症であるスポロトリコーシスの、PCR法による実用的なDNA診断法を確立するため、より適切なプライマーの設定を行ない、関連操作の改善を試みた。
まず、スポロトリコーシスの原因菌であるSporothrix schenckiiは、ミトコンドリアDNAの制限酵素解析によって少なくとも10数種類以上の遺伝子多型を有することが知られている。そこで、ATCC No.14284の菌株からDNA断片を分離し、複数の菌株で配列を比較し、多数の株に共通で、他の生物とは類似しない遺伝子にプライマーの設定を試みた。その結果、予備的に設定したプライマーでは30菌株中14株(46.7%)菌株でDNAの増幅がみられたのに対し、複数の菌株の塩基配列を考慮して作製したプライマーは、75菌株中69株(92%)でDNAの増幅が確認された。そして、その後さら多くの塩基配列を検討した。
次に、実用上の感度向上のため、微量かつ強固な真菌から確実にDNAを抽出する方法を検討した。まず、Zymolyaseやlyticase等の複数の酵素について、スライドカルチャー上の菌体への作用を観察した結果、酵素処理だけでは細胞壁の十分な破壊は困難であると結論した。そして、物理的な破砕と酵素処理を組み合わせ、固い皮膚組織中の、極めて微量の胞子型の菌体から確実にDNAを抽出する方法が必要と考えられた。以上の結果を統合することで、より実用的なスポロトリコーシスのDNA診断法が可能であると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] 杉田 泰之: "PCR法によるSporothinx Sckenckuの検出に関する検討-第2報-"日本医真菌学会雑誌. 39(sup1). 67 (1998)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "PCRによる診断"皮膚臨床. 41. 883-890 (1999)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "真菌症の遺伝子診断"Mebio. 6. 24-28 (1999)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "皮膚科領域の遺伝子診断1999up-to-date感染症"日本皮膚科学会雑誌. 109. 1984-1985 (1999)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "Sporothrix schenekuの膜輸送蛋白遺伝子のPCR-SSCPによる分類"日本医真菌学会雑誌. 40(sup1). 63 (1999)
• [文献書誌] Sugita Y: "Molecular analysis of DNA polymorphism of Sporothrir scheneku"Jpn J Med Mycol. 41. 11-15 (2000)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "PCR, 竹原和彦ら偏:KEY WORD 1999-2000皮膚疾患"先端医学社. 2 (1999)
• [文献書誌] 杉田 泰之: "真菌感染症の診断,皮膚科領域の感染症,診断と治療指針"メディカルレビュー社. 8 (1999)