| 研究概要 |
1. 網膜内メラトニン含量の測定
ラット網膜のメラトニン含量をHPLCおよび今回の科学研究費で購入した電気化学検出器(東ソー、EC-8020)を用いて測定することを試みた。Eicompak MA-5IDSカラムを使用して25%メタノール,25℃の条件で標準物質を流したところ,100pgまでメラトニンを検出することができた。各12時間の明暗サイクルで飼育したブラウンノルウェーラットを用いて暗期間の中間時点(午前2時)において暗赤色光下で網膜を摘出し,メラトニン含量の測定を行った。LucasらによるとC3Hマウスにおいて網膜内メラトニン含量は暗期間に持続的に高値を示し2眼で約50pgあったので,ラット網膜を4眼分プールしてメラトニン含量を測定した。しかしメラトニンに相当するピークは検出されなかった。今後,試料調整溶液の組成,カラムの条件などを変更してメラトニン検出感度の改善を図る予定である。
2. メラトニン合成酵素(serotonin-N-acetyltransferase,NAT)のmRNA量の測定
ラットNATcDNA塩基配列から1対のプライマーを設定し(5'-ATCTCAGTCTCGGGTACCTG-3'および3'-TGTCACCGACGACTGGGTTC-5'),ラット網膜から抽出したpolyA-RNAを鋳型としてRT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)を行った。目的の462塩基対のDNA断片が増幅され,RT-PCR産物の直接DNAシークエンスを行いNATcDNAに一致することが確認された。
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