G蛋白共役型受容体の細胞内局在の分子機構の解析.

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10771314
• 研究機関: 国立小児病院
• 研究代表者: 平澤 明 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 研究員 (70242633)
• キーワード: yeast two-hybrid法 / Green Fluorescent protein / α1Aアドレナリン受容体 / α1Bアドレナリン受容体 / gClqBP / フローサイトメトリー / レーザー共焦点顕微鏡

研究概要

受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、alA,alBアドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にした(Awaji et al,Mol Endcrinol 1998)。
また、受容体蛋白質を誘導発現できる培養細胞系を作製し、これを用いて局在、輸送機構に関する薬理学的な解析を行った(Hirasawa et al. Brit J Pharmacol 1998)。
さらに、局在の制御に関与すると考えられる蛋白質の検索のため、yeast two-hybrid法を用いalBアドレナリン受容体に結合する蛋白質としてgClqBPの単離に成功した。
この蛋白質のcDNAをalBアドレナリン受容体cDNAとともにco-transfectすると、同一の細胞内局在を示すこと、細胞を界面活性剤で可溶化後抗alBアドレナリン受容体抗体で免疫沈降を行うとgClqBPが共沈することなどから、発現した細胞内でも相互作用のあることが分かった。さらに、上記蛍光検出系を組み合わせることで、gClqBPが実際に受容体の発現量の制御にかかわることを明らかにした。
以上の結果から、受容体の発現の蛋白レベルでの制御に関する新規の因子を同定したと考えている(Zjxu et al J Biol Chem in press)。

研究成果

• [文献書誌] Tsujimoto G,Hirasawa A Sugawara T,Awaji T.: "Subtype-specific differences in subcellular localization and chlorethylclonidine in activation of α1-adrenoceptors" Life Sciences. 62(17/18). 1567-1571 (1998)
• [文献書誌] Shibata K,Hirasawa A,Foglar R Ogawa S,Tsujimoto G.: "Effects of Quinidine and Verapamil on human cardiovascular α1-adrenoceoptors." Circulation. 97. 1227-1230. (1998)
• [文献書誌] Take H,Shibata K,Awaji T,Hirasawa A,Takada T,Tsujimoto G,et al.: "Vasacular α1-adrenoceptor subtype selectivity and α1-blocker-induced orthostatic hypotension." Jpn.J.Pharmacol.77. 61-70, (1998.)
• [文献書誌] Hirasawa A,Awaji T,Sugawara T Tsujimoto A,Tsujimoto G.: "Differential mechanism for the cell surface sorting and the agonist-promoted internalization of a1B-adrenoceptor." Br.J.Pharmacol.124. 55-62. (1998)
• [文献書誌] Awaji T,Hirasawa A,Sugawara T,Izumi S,Tsujimoto G,et al: "Real-time optical monitoring of ligand-mediated internalization of α1b-adrenoceptor with green fluorescent protein." Mol.Endocrinol.12. 1099-1111 (1998)