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1.神経特異的な発現制御領域の同定のため線虫C.elegans unc-18遺伝子の上流域から種々のDNA断片をPCRで増幅し、Green Fluorescent Protein(GFP)又はβ-galactosidaseをレポーター遺伝子とする発現ベクターpPD95.75とpPD21.28に組み込み、C.elegans野生株に顕微注入した。得られたトランスジェニック線虫のGFP又はLacZの発現パターンを観察した結果、上流域-366から-53bpのDNA断片で神経特異的は発現を示した。
2.さらにこのことを検証するためにC.elegansの近種であるC.briggsaeのunc-18遺伝子上流域をクローニングし、C.elegans unc-18遺伝子とDNA配列を比較した。その結果C.elegans unc-18遺伝子上流域-359から341bpの範囲と非常に高い相同性を示す領域を見つけた。この19bpについてsite-directed mutagenesis法により2文字毎に塩基置換を行った発現ベクターを構築し、レポーター活性の局在を指標に神経特異的発現に必須なヌクレオチドを決定した。この結果から19bp内の5'ACX_4CCX_4TTG 3'配列がunc-18遺伝子発現に不可欠であることを明らかにした。
3.トランス因子同定のため19bp領域においてゲルシフトアッセイを行った。この結果19bpに結合する因子を同定した。また、この因子は19bpのsense-strand DNAを加えると特異的に結合が阻害されることから、single-strand DNAに結合することを明らかにした。
以上の結果からC.elegans unc-18の神経特異的な遺伝子発現は5'ACX_4CCX_4TTG 3'配列に特異的に結合する因子おいて制御されているとが示唆された。
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