一酸化窒素合成酵素のカルモジュリン、リン脂質、リン酸化による活性調節機構の解明

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10780391
• 研究機関: 藤田保健衛生大学
• 研究代表者: 松原 守 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助手 (90288481)
• キーワード: NO合成酵素 / リン酸化 / Cキナーゼ / プロテインキナーゼ / カルモジュリン / 一酸化窒素 / 血管内皮細胞

研究概要

本研究では、nNOS、eNOS、iNOSの各アイソフォームのカルモジュリン結合ドメインに着目し、このドメインと酸性リン脂質、カルモジュリンなど各種エフェクターとの相互作用、リン酸化によるその調節機構を解明することを目的としている。本年度はその中で特にeNOSのCキナーゼによるリン酸化の活性調節機構について初めて明らかにできた。
すなわち大腸菌で発現、精製したeNOSはCキナーゼで特異的にin vitroでリン酸化された。このリン酸化部位を明らかにするため、ある特定のリン酸化部位を認識できるような部位特異的抗リン酸化抗体を作製した。部位特異的抗リン酸化抗体を用いた実験よりカルモジュリン結合ドメイン内のThr497がリン酸化部位であることがわかった。また、このThr497のリン酸化はウシ大動脈血管内皮細胞を用いたin vivoの実験からも明らかとなり、細胞内においてCキナーゼによるこの部位のリン酸化が重要な役割を担っていることが示唆された。更に、このリン酸化の生理的な意義を調べるため、eNOSの活性に及ぼす影響を調べたところ、この部位のリン酸化によりeNOSの活性が減少することが分かった。そしてこの活性低下の原因として、Thr497のリン酸化によりカルモジュリンとの結合が阻害されたためカルモジュリンによる活性化ができなくなっていることが明らかとなった。このように、CキナーゼによるeNOSのカルモジュリン結合ドメイン内の特異的なリン酸化がその活性の負の調節に働いており、eNOSの活性調節機構の一つにリン酸化が大きく関与していることが明らかとなった。

研究成果

• [文献書誌] Hayashi, N., et al.: "An Expression System of Rat Calmodulin using T7 Phage Promoter in Escherichia coli." Prot.Expr.Purif.12. 25-28 (1998)
• [文献書誌] Matsubara, M., et al.: "MARCKS a major protein kinase C substrate, assumes non-helical conformations both in solution and in complex with Ca^<2+>-calmodulin" FEBS Lett.421. 203-207 (1998)
• [文献書誌] 松原 守: "Protein-Lipid, Protein-Protein InteractionにおけるN末端ミリスチル化の役割" J.Retrovirus Res.Communu.1. 11-13 (1998)
• [文献書誌] Nohara, D., et al.: "High Performance in Refolding of Streptomyces griseus Trypsin by the Aid of a ,Mutant of Streptomyces Subtilisin Inhibitor Designed as Trypsin Inhibitor" J.Biochem.125. 343-347 (1999)