新規がん抑制遺伝子DAN産物の機能解析

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10780449
• 研究機関: 千葉県がんセンター
• 研究代表者: 中村 洋子 千葉県がんセンター, 研究局・生化学研究部, 研究員 (60260254)
• キーワード: DAN蛋白質 / 分泌

研究概要

DAN蛋白質は、これまでの研究から細胞外に分泌されることが明らかになっている。しかしながら、細胞外に分泌されたDAN蛋白質がどのような分子機構を通して、細胞の増殖ならびにがん化を抑制するかについては不明である。そこで、DAN蛋白質の作用機構を解明する目的で本研究を行った。(1)DAN蛋白質はそのアミノ酸配列上、ヘパリン結合配列に類似した配列(105-PRVDKLVEKIVHC-117)を持つことから、ヘパリンに結合することが想定された。C-末端にflagを付加した融合蛋白質(DAN-flag)、あるいは、細胞外に分泌されたDAN蛋白質のヘパリン結合アガロースへの吸着能から、DAN蛋白質はヘパリン結合性を持つことが示唆された。(2)細胞外へ分泌されたDAN蛋白質のアミノ酸配列を解析したところ、アミノ酸16(Ala)と17(Ala)の間で切断されることが判った。そこで、DAN蛋白質の疎水性に富んだアミノ酸2-16番目を欠いたDAN(Δ(2-16)DAN)cDNAを構築し、COS細胞内でこの蛋白質を強制発現させた結果、Δ(2-16)DAN蛋白質は、細胞外へは分泌されないことが判明した。(3)DAN発現の認められない骨軟部腫瘍由来のSaos-2細胞にDAN cDNAを導入し、G418存在下でコロニー形成能を調べたところ、ベクターコントロールおよびΔ(2-16)DAN cDNAに比べて、コロニー数は明らかに減少していた。この結果より、分泌されたDAN蛋白質が、Saos-2細胞の増殖を抑制する可能性が示唆された。(4)ヒト各組織におけるDAN mRNAの発現をヒトRNA master blot(CLONTECH)を用いて検討した結果、成人の卵巣、前立腺、小腸、肺、大腸、膀胱、子宮において発現は高く、脾臓、膵臓では低発現であった。(5)マウス各組織でのDAN mRNAの発現をIn situ hybridization法により解析したところ、卵巣の卵胞上皮、肺の肺胞上皮および気管支粘膜上皮、小腸および大腸の粘膜上皮において高い発現が認められた。

研究成果

• [文献書誌] Hishiki,T.,Nakamura,Y.,et al.: "Glial cell line-derived neurotrophic factor/neurturin- induced differentiation and its enhancement by retinoic acid in primary human neuroblastomas expressing c- Ret,GFRα-1,and GFRα-2." Cancer Res.58. 2158-2165 (1998)
• [文献書誌] Nakamura,Y.,et al.: "Ectopic expression of DAN enhances the retinoic acid-induced neuronal differentiation in human neuroblastoma cell lines." Biochem.Biophys.Res.Comm.243. 733-726 (1998)
• [文献書誌] Enomoto,H.,Nakamura,Y.,et al.: "In vivo karyotypic evolution with altered biological characteristics in a case of neuroblastoma." J.Pediatr.Surg.33. 1404-1407 (1998)
• [文献書誌] Hiwasa,T.,Nakamura,Y.,et al.: "Isolation of a variant which has reduced activity from SH-SY5Y neurobalstoma cells." Anticancer Res.18. 3311-3314 (1998)
• [文献書誌] Hiwasa,T.,Nakamura,Y.,et al.: "Down-regulation of protein kinase C alfa and gamma and enhanced TPA-induced neurite formation in DAN-transfected neuroblastoma cells." FEBS Lett.440. 25-28 (1998)
• [文献書誌] Ichimiya,S.,Nakamura,Y.,et al.: "p73 at chromosome 1p36.3 is lost in advanced stage neuroblastoma but its mutation is infrequent." Oncogene. 18. 1061-1066 (1998)