C末端アミド化酵素がミエリンペプチドアミドの生合成に関与している可能性について

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10877023
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 野口 正人 久留米大学, 医学部, 教授 (10124611)
• 研究分担者: 高橋 研一 久留米大学, 医学部, 助手 (80250736) ; 緒方 英博 久留米大学, 医学部, 講師 (50108635)
• キーワード: アミド化 / ミエリンペプチドアミド / 大脳

研究概要

Myelin peptide-amideの合成に与る酵素の存在を調べるために、以下の手順に従い検索を試みた。
(方法)Myclin peptide-amideの基質アナログとして、D-Tyr-Lys-Tyr,D-Tyr-Lys-Tyr-Leu,D-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leuを合成し、これらのC末端Tyr残基にアンモニアを付加、あるいはC末端 Leu 残基をアミド基に転換する反応を触媒する酵素活性が、ウシ、ラットの大脳に存在するかを調べた。反応は、これらのペプチドと大脳homogenate、および下記の cofactorを添加して行った。反応停止後HPLCで分析し、期待されるアミド化ペプチドの生成の有無を調べた。生成物であるD-Tyr-Lys-Tyr-NH_2とD-Tyr-Ser-Lys-Tyr-NH_2も同時に化学合成した。(結果および今後の計画)生体内における種々のアミド化反応機構を考慮し、以下の反応を行った。(1)C端Leuの酸化的脱アルキル化(oxygenase reaction)をふまえ、ascorbate,NADH,FADH_2,glutathione,tetrahydropterinなどの還元剤と、銅イオンを添加。(2)C端Leuの酸化的解裂(oxidase rcaction)をふまえ、NAD^+,NADP^+,FAD,FMNなどの酸化型補酵素を添加。(3)C端Tyr残基へのtransaminationをふまえ、pyridoxal phosphateとAsp,Gluを添加。(4)C端Tyr残基へのエネルギー依存的なアンモニア付加をふまえ、ATP,無機アンモニア,Asp,Glu,MgCl_2,pyridoxal phosphateなどを添加。(5)ω-amidaseとhydroxyamine reductaseによるC端Tyr残基のアミド化をふまえ、NH_2OH,FAD,NADHを添加。以上の反応をウシおよびラットの大脳homogcnatcを粗酵素標品として用い、反応系のpHおよび反応時間(1hから24h)を変えて行ったが、期待されるアミド化ペプチドの生成を認めなかった。今後は、acylamideの合成過程に関与するといわれる、acyl-CoA:glycinc N-acyltransferaseや、新しい睡眠物質として話題を集めるcis-octadecenamideの合成に与るとされる fatty acid amide hydrolaseに類似の反応が、myelin peptide-amideの生成に関わっているかどうかを調べていく。

研究成果

• [文献書誌] Kenichi Takahashi: "The mechanism of peptidylglycine α-amidating reaction." PEPTIDE SCIENCE 1998. (in press). (1999)
• [文献書誌] Yoshiaki Omata: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies on the water soluble form of rat heme oxygenase-1 in complex with heme." Acta Crystallographica Section D. D54. 1017-1019 (1998)
• [文献書誌] Kenichi Takahashi: "Kinetic-isotope effects of peptidylglycine α-hydroxylating mono-oxygenase reaction." Biochemical Journal. 336(1). 131-137 (1998)
• [文献書誌] 野口正人: "量子論の基礎(2) -ESR・NMRを理解するために" 久留米医学会雑誌. 61. 183-187 (1998)
• [文献書誌] 高橋研一: "重水素効果によるペプチドC末端アミド化反応の解析" 生化学. 70(12). 1492 (1998)
• [文献書誌] 小俣義明: "ラットヘムオキシゲナーゼの大腸菌での大量発現と結晶化" 生化学. 70(12). 1493 (1998)
• [文献書誌] 坂本 寛: "ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解中間過程の検討" 生化学. 70(12). 1493 (1998)
• [文献書誌] 高橋研一: "ペプチドC末端グリシン水酸化反応機構の解析" 生化学. 70(8). 1071 (1998)
• [文献書誌] 坂本 寛: "ヘムオキシゲナーゼによる反応中間体ベルドヘム生成過程の検討" 生化学. 70(8). 1072 (1998)
• [文献書誌] Hiroshi Sakamoto: "Study on the mechanism of verdoheme formation in the heme oxygenase reaction" 「生体機能における金属イオンの特異的作用の分子化学」 第3回ワークショップ. 86 (1998)
• [文献書誌] Kenichi Takahashi: "Deuterium kinetic-isotope effects in peptidylglycine α-amidating monooxygenase reaction." Journal of Inorganic Biochemistry. 67. 54 (1997)
• [文献書誌] 野口正人: "量子論の基礎(1) -ESR・NMRを理解するために" 久留米医学会雑誌. 60. 309-313 (1997)
• [文献書誌] 小俣義明: "Porphobilinogen Deaminase及びUroporphyrinogen III Synthase のcDNAクローニングとその発現" 生化学. 69(12). 1420 (1997)
• [文献書誌] 小俣義明: "Porphobilinogen Deaminase及びUroporphyrinogen III Synthase のcDNAクローニングとその発現" 生化学. 69(7). 554 (1997)
• [文献書誌] 高橋研一: "ペプチドホルモンC末端アミド化反応機構の同位体効果による検討" 生化学. 69(7). 811 (1997)
• [文献書誌] 緒方英博: "ヒト心臓Peptidylglycine a-Amidating Monooxygenase(PAM)のcDNAクローニングと塩基配列の検討" 生化学. 69(7). 811 (1997)
• [文献書誌] 朝田慎也: "ヘム-ヘムオキシゲナーゼ複合体の結晶学的研究" 日本結晶学会講演要旨集. 166 (1997)
• [文献書誌] 緒方英博: "ヒトC末端アミド化酵素のクローニングと発現" 「生体機能における金属イオンの特異的作用の分子化学」第2回ワークショップ. 70 (1997)
• [文献書誌] 坂本 寛: "電子滴定によるヘムオキシゲナーゼ反応の中間過程の検討" 「生体機能における金属イオンの特異的作用の分子化学」第2回ワークショップ. 111 (1997)
• [文献書誌] 朝田慎也: "ヘム-ヘムオキシゲナーゼ複合体の結晶学的研究" 「生体機能における金属イオンの特異的作用の分子化学」第2回ワークショップ. 112 (1997)
• [文献書誌] Kenichi Takahashi: "Magunutude of intrinsic isotope effect in peptidylglycine α-amidating monooxygenase reaction." PRE-ICBIC-8 Okazaki Symposium. P-7 (1997)
• [文献書誌] Toshihiro Hidaka: "Cloning and expression of cDNA for soluble form of rat heme oxygenase-1." Kurume Medical Journal. 43. 313-324 (1996)
• [文献書誌] 野口正人: "医科生化学(竹重ら編)" (株)講談社サイエンティフィク, 352 (1999)
• [文献書誌] Yoshiaki Omata: "Oxygen Homeostasis and Its Dynamics(Y.Ishimura et.al.Eds.)" Springer-Verlag Tokyo, 620 (1998)