| 研究課題/領域番号 |
10877207
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| 研究機関 | 大分医科大学 |
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研究代表者 |
穴井 博文 大分医科大学, 医学部, 助手 (20291544)
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| 研究分担者 |
葉玉 哲生 大分医科大学, 医学部, 教授 (00145377)
平岡 善憲 大分医科大学, 医学部, 助手 (90253799)
小野 克重 大分医科大学, 医学部, 助手 (40253778)
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| キーワード | イオンチャネル / アデノウィルス / 心移植 / lacZ / 電気生理学 |
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| 研究概要 |
移植した心筋細胞にイオンチャネルの遺伝子(cDNA)を導入して電気的に機能するイオンチャネルを発現させることを目的として以下の手順で実験を行った。(1)ラット同種異所心移植モデルを作製した後、心筋に本来存在しないイオンチャネルのcDNAをアデノウィイルスを用いる方法で心筋細胞内に導入して、イオンチャネルを発現させることで移植心筋の電気興奮性の変化を調節する。(2)異種異所心移植モデルを作製して、拒絶をおこし拒絶心筋にイオンチャネルのcDNAを導入して拒絶心筋の興奮性を変化させる。結果として、(1)組み替えアデノィルスの作成:一過性外向き電流関連カリイムチャネルをコードする遺伝子(Kv4.1及びKv4.2)を含むアデノィイルスのィイルス懸濁液を作成。(1)入手したィルス液は力価が不十分なため、293細胞に感染させ、力価を109TCID50/mlまで上昇させた。(2)Kv4.1及び、Kv4.2pをECORlで切り出せるようなプラスミドを作成した。(8)発現ユニットをクローニングサイトに挿入するためコスミドカセットを用いてKv4.1を相同組み替えのため293細胞へ導入した。(4)ィルス液を遠心して 白層を取り除きィルスバンドを取り出した。(5)組み替えィルスの作成が完成したらバッファーとCsClによる超遠心を繰り返して精製しMOI500程度の感染粒子を得た。(2)組み替えィルスの移植心筋細胞内導入(In Vitro):Kvチャネルの遺伝子を自己DNAの一部に取り込んだ組み替えィルスのcDNAを、Ono-Linseyモデルで作成した、ラット腹腔内同種異所に移植した心筋層に導入をはかっている。目下、移植心筋内への導入遺伝子は電気生理学的に確認されておらず、導入効率の改善が期待される。高率にKvチャネルが導入されれば、単離心筋細胞のみならず、全心臓電流記録によって、発現チャネル電流が記録されると考えられる。
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