培養肺胞上皮細胞気管内注入による肺病変修復促進の分子生物学的検索-増殖因子(KGF)刺激

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10877242
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 須加原 一博 熊本大学, 医学部, 助教授 (20171126)
• 研究分担者: 杉田 道子 熊本大学, 医学部付属病院, 助手 (70305019) ; 吉武 淳 熊本大学, 医学部付属病院, 助手 (80291540)
• キーワード: 急性肺障害 / 肺胞上皮細胞 / 培養細胞 / サイトカイン / 創傷治療

研究概要

1. 培養肺胞II型上皮細胞気管内投与による投与細胞の動態-これまでの研究から近交系ラットの方が細胞生着率がよいため近交系ラット肺より肺胞II型上皮細胞を分離し、バクテオロジカルデイシュに一日培養。これまでの研究で培養細胞の機能(肺サーファクタント・アポ蛋白質の遺伝子発現など)保持が持続できるEngelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘍細胞の細胞外マトリックスをLabTechを用いて培養液中に浸して保持し、4-diamino-2-phenylindole(DAPl)やlipophilic dialkylcarbocyanines(DilorDiD)を用いて細胞核を染色してから他のラット肺に気管内投与した。数日後ラット肺を凍結固定し、あるいは組織をパラホルムアルデハイドで固定し、凍結切片あるいは超薄切片を作成して蛍光顕微鏡にて観察すると、投与した細胞が塊を作って肺胞壁に付着しており、形態的にも活性の高い生きた細胞が確認された。投与細胞と組織細胞の区別が充分可能なことも確認できた。培養細胞を肺胞上皮細胞増殖因子であるKGFで、12時間刺激(肺サーファクタント・アボ蛋白質の遺伝子発現の検索で、KGFの最大効果がみられる時間)し、DAPIあるいはDilで染色後、気管内投与してその動態を検索し、投与細胞も少し増殖している結果を得ている。少し細胞障害があると思われるため、染色しない培養細胞を気管内投与し、投与肺を組織学的、電顕的に検索している。正常肺では、投与細胞の30%近く生着。BrdUの取り込みを検索中。2. 呼吸不全動物肺での細胞動態変化-エンドトキシン、ブレオマイシンや塩酸による障害ラットを作製し、KGFで刺激した培養肺胞II型上皮細胞を呼吸不全動物ラット肺に気管内投与し、その投与細胞の動態と肺障害の程度を検索しているが、肺障害(肺水腫など)が強いためか肺胞壁まで達していなく付着した細胞が少ない。最適投与時期を検索中。障害後4〜7日頃に投与した方が付着細胞は多いようだ。障害発生後すぐにKGFを気管内投与し、その後KGF刺激培養肺胞上皮細胞を投与して肺障害抑制効果を検索している。3.今後の展望一肺障害作製後呼吸管理を併用してKGF刺激培養細胞を投与する研究も進行している。さらに、アデノウイルスを用いたgenetransferによる研究も検討し始めている。

研究成果

• [文献書誌] Kazuhiro Sugahara, et al.: "Differentail expression of OCAAT/anhancer binding protein (C/EBP) family in rat alveolar epithelial cell proliferation and in acute lung injury" Cell and Tissue Research. 295(in press). (1999)
• [文献書誌] Kauhiro Sugahara, et al.: "Duble intratracheal instillations of keratinocyte trowth factor prevents bleomycin-induced lung fibrosis in rats" Journal of Pathology. 186. 90-98 (1998)
• [文献書誌] Kazuhiro Sugahara, et al.: "The transcription factor,C/EBP family members are differentialy expressed in acute lung injury, in C/EBP β-deficinet, and in C/EBP β-deficinet mice" Molecular Biology of the Cell. 9. 75a-75a (1998)
• [文献書誌] Kauhiro Sugahara, et al.: "Elevation of serum human hepatocyte growth factor (HGF) level in patients with pneumonectomy furing a perioperative priod" Intensive Care Medicine. 24. 434-437 (1998)
• [文献書誌] Kazuhiro Sugahara, et al.: "NADH-diaphorase deficiency was indentified in the patients with congenital methaemoglobinaemia detected by pulse oximetry" Intensive Care Medicine. 24. 706-708 (1998)
• [文献書誌] Kazuhiro Sugahara, et al.: "Effects of soluble factors and extracellular matrix on DNA synthesis and surfactant gene expression in primary cultures of rat alveolar type II cells" Cell and Tissue Research. 291. 295-303 (1998)