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1) chimeric receptorの作成
pGEM3Z vector上のヒトβ2アドレナリン受容体のTMD#4をrestriction enzymeを用いて切り出した。オピオイドμ受容体のTMD#4の塩基配列とrestriction siteを持つoligodeoxynucleotide(ODN)を作成しannealし、TMD#4を切り出したヒトアドレナリン受容体とこのODNをT4 ligaseを用いてligationした。これをmaxiprepし、Sanger法によるsequence analysisによって目的のキメラ受容体が得られているのを確認した後、このキメラ受容体をpCDNA3 vectorに移した。
2) chimeric receptorのtransient transfection(DEAE dextran法)
70%confluentとなったCOS7 cellをconstructを挿入されたpCDNA3 vector、及びDEAE dextranを含んだPBSとともにincubateした。48から72時間後にcell membraneをharvestした。
3) chimeric receptorの機能解析(radiolabelled ligand binding assay)
hot ligandとしてadrenergic ligandである3H-DHAを用いたbinding isothermを行いKd valueを求めようとしたが、このキメラ受容体は、3H-DHAに対して、親和性を認めなかった。すなわちこのキメラ受容体は、non-functionalであった。
以上より、アドレナリン受容体とオピエートμ受容体の相同性は、TDM#4に関してはないと考えられる。
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