| 研究課題/領域番号 |
10878130
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 健治 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (70011533)
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| 研究分担者 |
西井 亘 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (30287461)
中村 健 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (50227906)
工藤 佳久 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (20080179)
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| キーワード | 二重蛍光標識基質 / 細胞内プロテアーゼ / 細胞内プロテオリシス / 可視化解析 / FRET(蛍光共鳴エネルギー転移) / CAAXモチーフ特異的プロテアーゼ / コラゲナーゼ |
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| 研究概要 |
1. Rasタンパク質のC末端イソプレニル化CAAXモチーフに特異的に作用する細胞内プロテアーゼを標的とする二重蛍光標識基質FITC-AAAAAC(ファルネシル)VI-EDANS(FITC:フルオレッセインイソチオシアナート;EDANS:5-(アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸)の合成を試み、ペプチド合成はFmoc固相法で行い、合成した基質ペプチドの両末端に溶液中でそれぞれ2種の蛍光試薬(FITCとEDANS)を結合させ、合成産物をHPLCで精製した。しかし、この方法では収率が極めて低く、大量調製は困難であり、さらにこれらの点を改良すべく検討を進めている。
2. 上記方法とは独立に、ペプチド固相合成と蛍光基付加の過程を一体化し、効率よく二重蛍光標識基質を合成する法を考案した。固相合成の際に、プロテアーゼによる認識配列の前後にLys(Σ-Fmoc)を導入し、そのΣ-アミノ基に蛍光基を遂次導入する。この手法により、任意のLysのΣ-アミノ基に選択的に蛍光基を導入することが可能であり、合成産生の精製も容易となる。この方法で、コラゲナーゼの確認配列(PLGP)を含むΚ(ΣTRITC)PLGPAK(ΣTITC)(TRITC:テトラメチルローダンルートダミンインチオシアナート)を効率よく合成できた。この基質は試験管内テストで、FRET(蛍光共鳴エネルギー移転)による蛍光スペクトル変化をコラゲナーゼ作用により示すことが判明したので、今後この方法により各種二重蛍光標識基質を調製することが可能となった。
3. 二重蛍光標識基質を細胞内に導入するモデル実験として、ダンシル-KTKSKC(ファルネシル)VIMをC2C12細胞に導入し可視化解析することを試みた。生きた細胞のままで、本試薬を細胞内に導入することはできたが、プロテオリシスの追跡はこの基質では困難であるので、上記方法で合成した基質を用いる検討を進めている。
4. 細胞内プロテリオリシスの標的候補となりうる数種のプロテアーゼについて、精製と性状検索および遺伝子構造解析等を行った。
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