神経変性疾患と悪性腫瘍の分子医学

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 10CE2006
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 高橋 雅英 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40183446)
• 研究分担者: 古川 鋼一 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (80211530) ; 祖父江 元 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (20148315) ; 村松 喬 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00030891) ; 浜口 道成 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90135351)
• キーワード: 神経変性疾患 / 悪性腫瘍 / RET遺伝子 / ミッドカイン / 糖鎖合成酵素遺伝子 / Src遺伝子 / 浸潤・転移 / ノックアウトマウス

研究概要

1.GDNF-RET系の神経細胞の生存、分化に関わるシグナル系の解析
神経細胞のgrowth coneにおけるRacの活性化はその形態形成に重要な役割を果たしていることが知られている。今回、RETを介したRacの活性化にはRETのPKAによるリン酸化が必須であることを明らかにした。RETのコドン696のセリンのリン酸化がRacの活性化とその結果として生じるlamellipodia形成に必須であった。
腸管神経細胞の分化異常によって発症するヒルシュスプルング病で同定されたRETのキナーゼドメインの10個の変異が、RETの機能にどのような変化を生じるか解析した。その結果、5つの変異はRETのキナーゼ活性を完全に失活し、4つの変異はキナーゼ活性の部分的な失活とPLCγの著しい活性障害を示した。さらに1つの変異はRETの発現障害を生じることを明らかにした。
2.筋萎縮性側索硬化症(ALS)の分子病態
ALS病変部位での発現遺伝子プロファイリングを行うことによりクローニングした新規分子Dorfinの機能解析を行った。Dorfinは孤発性および変異SOD1を伴う家族性ALSの脊髄運動ニューロン内に見られるユビキチン化封入体に局在し、また変異SOD1による神経毒性に対しては、変異SOD1をユビキチン化し、プロテアソームによる分解を促進することにより、神経保護的に機能する分子であることを明らかにした。
3.ミッドカイン受容体の同定とシグナル伝達
ミッドカインの細胞内取り込みは、その抗アポトーシス活性に関与すること、そしてこの取り込みにはlow density liprotein receptor related protein(LRP)が必須であることを見出した。細胞内に取り込まれたミッドカインは核へ移行するが、この際、ミッドカインはヌクレオリン、ラミニン結合蛋白質前駆体と複合体を形成することが判明した。またLRPのファミリーでかつWntの受容体成分であるLRP6もミッドカインと強く結合することを見出した。
4.酸性糖脂質糖鎖の神経機能における役割
酸性糖脂質糖鎖の合成酵素遺伝子変異マウスを用いて、糖脂質糖鎖の神経系における役割を解析した。GM2/GD2合成酵素遺伝子の欠損、マウスでは、加齢に伴う末梢神経の変性と舌下神経の再生能の低下が見られた。またGD3合成酵素遺伝子ノックアウトマウスでは脳の形態形成には著明な異常が見られなかったが、神経再生能に低下が見られた。これらの2種の遺伝子変異マウスよりダブルノックアウトマウスを作製したところ、GM3のみを発現するマウスが出現し、早期の神経変性、突然死、皮膚炎、異常行動などを認めた。以上より複合型ガングリオシドが神経系の維持と再生に必須であることが示された。
5.癌の浸潤、転移を制御するシグナル伝達
v-Src, v-Crk等で癌化した細胞を用いて、癌細胞の浸潤転移を制御するシグナル伝達系を解析した。v-Crk癌化細胞は、フィブロネクチンへの接着は正常と変わらない活性を有するが、接着につづくフィブロネクチン上での細胞体の展開が著しく阻害されている事を見い出した。種々のドミナントネガティブ遺伝子を用いて、この細胞体展開の異常がRas-MEK-MAPK系を介して制御されている事を明らかにした。さらに、v-Src靴細胞を用いて、ヒアルロン酸がCD44を介して、癌細胞の運動性を腫瘍特異的に活性化する事、この活性化にはRas-MAPK系及びPI3K-Akt系が関与している事を明らかにした。カベオリンは、癌抑制遺伝子としての機能が報告されているが、カベオリンの腫瘍特異的な遺伝子異常を検索した結果、人乳癌組織に特異的な点突然変異を見い出し、この変異型カベオリンが細胞の浸潤を亢進させる事を明らかにした。
6.活性型RETを介したシグナル伝達の解析
yeast-two hybrid法を用いて活性型RETと結合する蛋白を検索した結果、アダプター蛋白のDok1がRETのチロシン1062と強く結合することを証明した。さらにDok1はRAS-GAPと結合することにより、RAS/ERK系の活性を負に制御し、NCKと結合することによりJNKを活性化することを明らかにした。さらにJNKの活性化はMEN2B型変異RETを発現する細胞でより強くみとめらることから、MEN2Bの表現型の形成に関与していることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Hayashi, K.: "Invasion activating caveolrn-1 mutation in human scirrhous breastcancers"Cancer Res.. 61. 2361-2364 (2001)
• [文献書誌] Takei, Y: "Antisense oligodeoxyrnicleotide targeted to midkine, a heparin-binding growth factor, suppresses tumorigenicity of mouse rectal carcinoma cells"Cancer Res.. 61. 8486-8491 (2001)
• [文献書誌] Iwashita, T.: "Functional analysis ofRET with Hirschsprung's mutations affecting its kinase domain"Gastroenterology. 121. 24-33 (2001)
• [文献書誌] Adachi H.: "Transgenic mice with an expanded GAG repeat controlled by the human AR promoter show polyglutamine nuclear inclusion and neuronal dysfunction without neuronal cell death"Hum. Mol. Genet.. 10. 1039-1048 (2001)
• [文献書誌] Qiao, S.: "Differential effects of leukocyte common antigen-related protein on biochemical and biological activities of RET-MEN2A and RET-MEN2B mutant proteins"J. Biol. Chem.. 276. 9460-9467 (2001)
• [文献書誌] Qi, M.: "Haptotactic migration induced by midkine: Involvement of protein-tyrosine phosphataseζ, mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase"Biol. Chem.. 276. 15868-15875 (2001)
• [文献書誌] Murakumo, Y: "Interaction in the error-prone psot-replication repair proteins, hREV1, hREV3, and hREV7"Biol. Chem.. 276. 35644-35661 (2001)
• [文献書誌] Iwamoto, T.: "Lactosylceramide is essential for the osteoclastogenesis mediated by the macrophage-colony stimulating factor and receptor activator of NF-kB ligand"Biol. Chem.. 276. 46031-46038 (2001)
• [文献書誌] Sato, W.: "Midkine is involved in neutrophil infiltration into the tubulointerstitium in ischemic renal injury"J. Immunol.. 167. 3463-3469 (2001)
• [文献書誌] Sohara, Y.: "Hyaluronan activates cell motility of v-Src-transformed cells via Ras-MAPK and P13K-AId in a tumor-specific manner"Mol. Biol. Cell. 12. 1859-1868 (2001)
• [文献書誌] Kurokawa, K.: "Identification of SNT/FRS2 docking site on RET receptor tyrosine kinase and its role for signal transduction"Oncogene. 20. 1929-1938 (2001)
• [文献書誌] Liu, Y.: "Suppression of cell spreading by v-Crk requires Ras-MEK-MAP kinasesignaling"Oncogene. 20. 5908-5912 (2001)
• [文献書誌] Hashimoto Y.: "A rescus factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer's disease genes and Ab"Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98. 6336-6341 (2001)
• [文献書誌] Okada, M.: "b-series ganglioside deficiency exhibits no definite changes in the neurogenesis and the sensitivity to Fas-mediated apotosis, but impairs regeneration of the lesioned hypoglossal nerve"J. Biol. Chem.. 277. 1633-1636 (2002)
• [文献書誌] Kato, M.: "Repair by Src kinase of functional-impaired RET-MEN2A with mutations at tyrosines in carboxyterminal kinase domain"Cancer Res.. (in press).
• [文献書誌] Mitsuda, T.: "Over-expression ofganglioside GM1 results in the dispersion of platelet derived growth factor receptor from glycolipid-enriched microdomains and in the suppression of cell growth signals"J. Biol. Chem.. (in press).
• [文献書誌] Yoshihara T.: "Differential expression of infilamation-and apoptosis-related genes in spinal cord of a mutant SOD 1 transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis"J. Neurochem.. (in press).