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視物質は動物の視覚を担う光センサー蛋白質であり、レチナールを発色団として持っている。視物質には吸収波長制御のための分子内機構が備わっている。例えば、可視光感受性視物質の発色団がプロトン化しているのに対し、紫外光感受性視物質の発色団は脱プロトン化している。しかし、そのような分子内機構の多様性が吸収波長以外の視物質の性質に与える影響は明らかになっていない。そこで本研究では、そのような分子内機構の多様性がG蛋白質やキナーゼとの相互作用効率に与える影響の検証を目的とする。そのためには、培養細胞発現系で視物質の部位特異的変異体を調製する必要がある。また、相互作用をより生体内に近い条件で測定するためには、各蛋白質を精製して水溶液中で測定を行うよりも、細胞膜上で測定する方が望ましい。以上のことから本年度は、培養細胞系で発現させた視物質がキナーゼによってリン酸化される速度を膜条件において測定する系の確立を試みた。試料としては、哺乳類培養細胞系において十分な発現量が得られるウシロドプシンと、網膜からの調製が容易なコイ桿体視細胞を用いた。当初は、培養細胞系で発現させたウシロドプシンを精製後リポソームに再構成し、キナーゼを含むコイ視細胞膜と融合させることを計画していた。ただ、この方法を用いるとコイ視細胞膜に存在する内在性の視物質の存在により測定が困難になることが懸念された。そこで、昆虫培養細胞系でコイのキナーゼを発現・精製し、発現・精製ウシロドプシンを含むリポソーム(またはウシロドプシンを発現した培養細胞膜)と混合して測定を試みた。その結果、キナーゼによるウシロドプシンのリン酸化速度を測定することに成功した。
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