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生命の最小単位は細胞である。そのため、医療の分野や生命の本質を探るような研究分野では単一細胞レベルでの情報を得ることが必要とされている。本研究では、1つの反応容器内で熱変化のみで細胞から直接RT-PCRを行う、Hot cell-direct RT-PCRを考案し、単一細胞分離と単一細胞レベルでのHot cell-direct RT-PCRによる発現遺伝子の検出が一つのデバイス上で可能かを検討した。真核生物のモデル細胞としてヒト白血球ガン細胞のJurkat cellを用いて、そのハウスキーピング遺伝子であるGAPDHのmRNAをターゲットとして研究を行った。
一般的なCell-direct RT-PCRでは、lysis bufferで細胞を破壊した後に、RT-PCR試薬と混合し、反応を行う必要がある。しかし、本研究では細胞の単離を行った後、そのまま溶液交換を行わずに細胞から直接RT-PCRを行う必要があるため、細胞からワンステップでのRT-PCR手法について検討を行った。シンプルな細胞の破壊方法としては熱による細胞の破壊方法がある。しかし、一般的な逆転写酵素では細胞膜を破壊するために高温にした際、熱で酵素が失活してしまう。そのために、本研究では高温条件下でも失活せず、逆転写活性を持つTth polymeraseを使用した。結果、細胞からの直接RT-PCRが可能であり、Hot cell-direct RT-PCR後の電気泳動結果から、GAPDHのmRNAだけを検出する事が可能であることが確認された。さらに、細胞単離デバイス上での細胞からの直接RT-PCRの条件も検討し、実際に細胞を単一分離し、RT-PCRによって発現遺伝子の増幅に成功した。
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