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本年度は、血管異常収縮の原因分子であるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)が、OHラジカル依存的にスフィンゴミエリン(SM)から産生されることを、分子・細胞レベルで証明するための研究を行い、以下の成果を得た。
1)分子レベル:フェントン反応で発生させたOHラジカルによって、SMからSPCが産生されることを直接証明するため、OHラジカルおよびSPCを物質として直接定量化した。即ち、ESR測定法によりOHラジカルを同定・定量化し、また、安定同位体元素を標識したSPCを内部標準としたMS/MS測定法(MRM)を用いて、SPCを定量化し、以下の結果を得た。
(1)フェントン反応の基本条件である『鉄イオン・過酸化水素・酸性側pH』という条件において、OHラジカルが著明に産生され、その反応溶液中にSMが存在する場合、SPCが経時的に産生された。
(2)フェントン反応の抑制剤存在下では、(1)のSPCの産生量が顕著に抑制された。以上より、OHラジカル依存的にSPCが産生されることが直接証明された。
2)細胞レベル:本研究では、SPC産生メカニズムの基盤として、酸性側pH且つ過酸化水素が豊富な、マクロファージのライソゾーム中における赤血球消化を想定している。そこで、ヒト単球系細胞THP-1を、PMA刺激によりマクロファージ様細胞に分化させた後、オプソニン化した赤血球を貪食させ、SPC産生量を測定した。現在、貪食時間等を最適化している段階ではあるが、通常の赤血球を貪食させた場合では、SPC産生量が増加するのに対し、ヘモグロビン不含の赤血球膜ゴーストを貪食させた場合では、SPC産生量は増加しないという結果を得ることに成功した。さらに、ライソゾーム中でのSMの分解という点において、本仮説によるSPC産生と競合するASMaseのsiRNAによるノックダウンを目指し、ウエスタンブロット条件の検討を行い、結果として、微量サンプル中でのASMaseの検出に成功した。
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