| 研究概要 |
(1)異種核多次元NMR法をもちいた生細胞内蛋白質のダイナミクス解析
In-cell NMRにより得られた,大腸菌細胞内におけるTTHA1718蛋白質の^<15>N-T_2緩和時間への化学交換による寄与R_<ex>を明らかするため,TROSY-selected spin-echo実験を行った。R_<ex>はこの実験により得られる交差相関緩和速度定数から算出することができる。
In-cell NMRによりこの実験を行い、得られたデータを解析した結果,in vitro,および in vivoで観測された^<15>N-T_2緩和時間の差異を説明するに足る規模でのR_<ex>は観測されなかった.今後は引き続きこの差異の原因を解明するため,CLEANEX-PM測定による,より広いタイムスケールでのダイナミクス解析を行う.
(2)真核細胞蛋白質大量発現系をもちいたin-cell NMR測定法の確立
本研究では,大腸菌細胞を利用したin-cell NMRにより,世界で初めて細胞内における立体構造決定がなされたTTHA1718蛋白質を目的蛋白質とし、Bac-to-Bac systemにより組み換えバキュロウイルスを作製した。作製したバキュロウイルスを感染させ,細胞内に目的蛋白質を発現したsf9細胞を測定試料とし,in-cell NMRによる2D ^1H-^<15>N HSQC測定を試みた.
TTHA1718蛋白質を発現させたsf9細胞を試料とし,2D ^1H-^<15>N HSQC測定を行った結果,sf9細胞内から目的蛋白質のNMRシグナルの観測に成功した.現在までに,真核細胞内で蛋白質を発現させ,その細胞を測定試料とし多次元NMR測定に成功した例は報告されておらず,本研究結果が第一例目の結果となる.今後は蛋白質主鎖の化学シフトを行うための3次元3重共鳴NMR測定,およびNOESY測定を行い,sf9細胞内での蛋白質の立体構造決定を目指す.
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