| 研究概要 |
藍色細菌は生物時計を持つ唯一の原核生物である。藍色細菌生物時計分子装置は時計タンパク質KaiA、KaiB、Kaicで構成されており、それらのタンパク質が複合体形成を変化させることで時計を刻んでいると考えている。タンパク質の複合体がいつ形成され、どこで相互作用するかを検証することで、生物時計を原子レベルで解明できる。私は、KaiBに注目し、KaiBとKaiAの相互作用部位を同定し、KaiBの構造変化について解析を行った。
まず、KaiBにラジカルを持ったスピンラベル(MTSSL)を導入し電子スピン共鳴(ESR)法でKaiAやKaiCとの相互作用を調べた。スピンラベルを導入するためにCys残基導入KaiB変異体を25種類作製した。作製したKaiB変異体を精製し、それぞれにMTSSLを導入した。KaiAはC末端ドメインでKaiBと相互作用することがわかっている(Mutoh et al.,2010)。そこで準備したKaiB変異体のうち、18種類とKaiAのC末端ドメインタンパク質(KaiAc)と反応させたところ、2種類のKaiB変異体でESRスペクトルに大きな変化が認められた(KaiB_<E56c>、KaiB_<D57c>)。このうち、KaiB_<E56c>を用いてKaiA、KaiCと反応させたところ、KaiB-KaiA相互作用は反応開始後10時間目以降から起き始めることが分かった。
次に、KaiBの構造変化について検証した。KaiBの2つの2量体境界面と表面にそれぞれMSLを導入したところ、4℃でのESRスペクトルには、速い成分と遅い成分の二成分が含まれ、スペクトルは4℃では24時間保温しても変化しなかったが、40℃で24時間保温すると速い成分に収束した。一方、KaiBの表面にラベルを導入した変異体では、4℃でも40℃でもスペクトルは変化しなかった。したがって、KaiBの構造は温度によって2量体境界面で大きく変化すると考えられた(Mutoh et al.,2011)。
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