超精密分子認識を目的とする新世代抗体の創製

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11132201
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 後藤 順一 東北大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (80006337)
• キーワード: 非競合型イムノアッセイ / モノクローナル抗体 / 抗イディオタイプ抗体 / 抗メタタイプ抗体 / 人工抗体 / ハプテン / 胆汁酸代謝物 / 11-デオキシコルチゾール

研究概要

低分子量生理活性物質(ハプテン)に対する抗体の親和定数(Ka)は最大10^<12>M^<-1>程度と低く、しかも必ずしも十分な分子認識能を示さない。この問題を克服するために、従来調製が困難とされているモノクローナル抗メタタイプ抗体及び抗イディオタイプ抗体(抗ハプテン抗体の可変部を、抗原の存在下又は非存在下に特異的に認識する第二抗体)を免疫化学及び細胞生化学的技術を駆使して作製することを試みた。さらに、遺伝子レベルで抗体分子の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列をランダムに変換して人工抗体(超抗体)ライブラリーの構築を試みた。
抗メタタイプ及び抗イディオタイプ抗体の創製 既にウルソデオキシコール酸 7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA 7-NAG)に対するモノクローナル抗体可変部のフレームワーク及びパラトープを認識するαタイプ、βタイプのモノクローナル抗イディオタイプ抗体の樹立に成功した。そこで、これらを組み合わせて非競合型イムノアッセイを試みた。本アッセイ系で用量作用曲線を作成したところ、優れた感度(検出限界70fg = 118amol)が得られた。また臨床応用上有利な特異性を示し、ヒト尿試料中のUDCA 7-NAG 及びそのグリシン、タウリン抱合体を群特異的に測定することが可能であった。本アッセイは、とくに原発性胆汁性肝硬変症の診断に有用と期待される。なお、11-デオキシコルチゾール(11-DC)についても同様に抗イディオタイプ抗体を樹立し、好感度な非競合型アッセイを確立した。
超抗体の創製 11-DC抗体産生株から増幅したV_H及びV_LドメインのDNAを連結して一本鎖Fvフラグメント(scFv)遺伝子を構築し、可溶型scFvを調整したところ、11-DCに極めて高い親和力(Ka 1.3x 10^<10>M^<-1>)を示した。また、各種の近縁ステロイドや抗イディオタイプ抗体との反応性から、本scFvはオリジナル抗体と類似のパラトープ構造を有し、その性質を十分に保持していることが示された。本フラグメントを出発物質としてミュータント抗体ライブラリーを構築し、天然型抗体を上回る親和力、特異性を有する新規抗体分子種の探索が可能と期待される。

研究成果

• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Characterization of choly-adenylate in rat microsomes by liquid chtomatography/electrospray ionization mass spectrometry"Analytical Biochemistry. 266. 125-132 (1999)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Covalent binding of bile acid acyl glucuronide with protein"Analytical Sciences. 15. 213-215 (1999)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Separation and detection of bile acid 24-glucuronides in human urine by liquid chromatography combined with electrospray ionization mass spectrometry"Analytical Sciences. 15. 625 (1999)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Production and characterization of monoclonal recognizing the asymmetric center of optically active bufuralol and its metabolites"Analytical Sciences. 16. 31-35 (2000)
• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Determination of the hepatic enzyme activity catalyzing bile acid acyl glucuronide formation by high-performance liquid chromatogrphy with pulsed amperomeiric detection"Biomedical Chromatography. ( in press ).
• [文献書誌] Norihiro Kobayashi: "A monoclonal anibody-based enzyme-linked immunosorbent assay of ursodeoxycholic acid 3-sulfates in human urine"Journal of Steroid Biochemistry and Molrcular Biology. ( in press ).