複製開始蛋白質DnaAのX線結晶構造解析による高次構造の決定と機能部位解析

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11143209
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 黒田 照夫 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助手 (80304327)
• 研究分担者: 月原 冨武 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00032277) ; 土屋 友房 岡山大学, 薬学部, 教授 (80012673)
• キーワード: DNA複製 / 癌 / 開始因子 / ATP結合 / ATPase / DnaA / ORC / Cdc6p

研究概要

1、試験管内でDnaAを活性化する因子として、酸性リン脂質が知られている。我々はDnaA蛋白質の372番目のリジンが、膜リン脂質と相互作用することを見出した。さらにを遺伝学的解析から、このアミノ酸に変異を持つDnaAが、細胞内で機能することを見出した。
2、我々は既に、複製された直後の再複製開始制御にDnaAのATPaseが関与していることを報告している。本年度、我々はこのATPaseの促進因子を発見し、遺伝学的にそれがDNAポリメラーゼのβサブユニットであることを見出した。
3、我々はこれまでDnaAの種々の活性に預かる機能ドメインの決定を行ってきた。その結果、DnaA同士の相互作用に預かる機能ドメイン以外はすべてその決定に成功した。一方、DnaAのN末端部位の機能も未解明であった。我々はDnaA蛋白質のN末端の疎水性のアミノ酸残基が多くの原核生物でよく保存されていること、及びそのアミノ酸群が、ロイシンジッパー様構造(蛋白質の重合に関与)をとることを発見し、N末端がDnaA蛋白質同士の相互作用に関与していると考え、その証明に成功した。
4、真核生物の染色体DNA複製開始の最初の段階であり、且つ律速段階であるORCとCdc6pの相互作用ですら、これまでその試験管内再構成系は確立されておらず、複製開始制御機構の解明を困難にしてきた。本年度我々は、そのOCRとCdc6pの相互作用の試験管内再構成に世界で始めて成功した。そしてその再構成系を使い、その相互作用がDNA依存であることなどを明らかにした。
5、ORCのATPaseが、ORCのCdc6pとの結合を負に制御していること、すなわち再複製開始を制御していることを見出した。一方、Cdc6pのATPaseに関しては、ORCがoriginに特異的に結合するのを促進するという機能を果たしていることを発見した。

研究成果

• [文献書誌] Makise,M.et al.: "Identification of amino acids involved in the functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids"J.Biol.Chem.. (in press).
• [文献書誌] Yamaguchi,Y.,et al.: "Involvement of Arg-328,Arg-334,and Arg-342 of DnaA protein in the functional interaction with acidic phospholipids"Biochem.J.. 340. 433-438 (1999)
• [文献書誌] Makise,M.et al.: "Identification of a high-copy-number plasmid suppressor of a lethal phenotype caused bymutant DnaA protein witch has decreased intrinsic ATPase activity"Biol.Pharm.Bull.. 22. 904-909 (1999)
• [文献書誌] Mima,S.et al.: "Role of the amino-terminal region of the DnaA protein in opening of the duplex DNA at the oriC region"FEMS.Micro.Lett.. 176. 163-167 (1999)
• [文献書誌] Shimamoto T.et al.: "A retroelement in Vibrio cholerae"Mol.Miceobiol.. 34. 631-632 (1999)
• [文献書誌] Inoue H.,et al.: "Expression of functional Na+/H+ antiporters of helicobacter pylori in antiporter deficient Escherichia coil mutants"FEBS Lett.. 443. 11-16 (1999)