細胞機能を制御する蛋白質ユビキチン化の機構解明

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11144239
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 本多 玲子 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (20277255)
• 研究分担者: 田中 弘文 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (30146899) ; 安田 秀世 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (40111554)
• キーワード: ユビキチン / プロテアソーム / p53 / MDM2 / SUMO-1 / UBC9

研究概要

(研究目的)
癌抑制遺伝子産物p53はユビキチン-プロテオソーム系により分解されることが如られている。一方、ユビキチン類似タンパク質Sumo-1が新たなタンパク質修飾系として注目を集めてきた。本研究ではp53のユビキチン化の機構を解明すると共に、p53が上記の新たな修飾SUMO-1化を受ける可能性も検討することとした。
(結果)
各種タンパク質をバキュロウイルス発現系、大腸菌発現系を用いて発現、精製後、ビオチン標識ユビキチンを用いて試験管内でタンパク質のユビキチン化反応をおこなった。ビオチン標識ユビキチン化タンパク質はSDSポリアクリルアミド電気泳動の後、パーオキシダーゼ標識アビジンによって検出した。点突然変異はPCR法を用いて導入した。またSUMO-1化も同様な方法をもちい、試験管内反応を行い、さらに細胞でのレポーターアッセイはルシフェラーゼ系を用いた。
1、MDM2はE1およびUBCH5存在下、p53をユビキチン化するユビキチンリガーゼとして働く。また自己ユビキチン化もおこり、それらの活性はC末にあるリングドメイン構造に依存していた。
2、p53は試験管内、および細胞内においてもSUMO-1化されその部位はC末端側に3箇所あることが明かとなった。
3、SUMO-1或いはUBC9を細胞に移入するとp53の転写因子としての活性が増加するが、SUMO-1化されないp53の変異型はSUMO-1或いはUBC9の移入で活性に変化は生じなかった、

研究成果

• [文献書誌] Honda, R.: "Activity of MDM2, a ubiquitin ligase, toward p53 or itself is dependent on the Ring finger domain of the ligase"Oncogene. 19(印刷中). (2000)
• [文献書誌] Honda, R.: "Association of p19ARF to Mdm2 inhabits ubiquitin ligase activity of Mdm2 for tumor suppressor p53"EMBO J.. 18. 22-27 (1999)
• [文献書誌] Okuma, T.: "In vitro sumo-1 modification requires two enzymatic steps, E1 and E2"Biochem, Biophys. Res. Commun.. 254. 693-698 (1999)
• [文献書誌] 本多玲子: "癌抑制遺伝子産物p53のユビキチン依存性分解制御機構"実験医学. (印刷中). (2000)
• [文献書誌] 安田秀世: "癌抑制遺伝子産物p53のユビキチン化の制御機構"Molecular Medicine. 37. 186-197 (2000)
• [文献書誌] 本多玲子: "MDM2によるp53の分解調節機構"細胞工学. 18. 655-663 (1999)