ヒスチジン脱炭酸酵素における小胞体への翻訳後ターゲティングの調節機構

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11153210
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 市川 厚 京都大学, 薬学研究科, 教授 (10025695)
• 研究分担者: 田中 智之 京都大学, 薬学研究科, 助手 (40303846)
• キーワード: 翻訳後ターゲティング / ヒスチジン脱炭酸酵素 / 熱ショック蛋白 / 小胞体移行シグナル / GST融合タンパク / pull-down assay法 / ラット好塩基球細胞株 / GFP融合タンパク

研究概要

本年度の研究実施計画に基づき、以下の研究成果を得た。
1.翻訳後ターゲティングの調節機構の解析:
[^<35>S]メチオニン標識ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)を調製し、細胞質成分と反応させて標識HDCのイヌ膵臓ミクロソーム膜への移行を検討した。その結果、HDCの移行反応にATPの加水分解反応が必要であることがわかった。また、抗Hsc70抗体を用いての免疫沈降実験により、HDCの移行反応に熱ショック蛋白のHsc70が関与していることを明らかにした。
2.小胞体移行シグナルの同定:
すでに、これまでの実験で、小胞体移行におけるHDCのC-末端鎖の関与を明らかにしている。本年は、C-末端鎖の移行シグナルを有するドメインが、C-末端鎖の588番目から607番目までの20アミノ酸残基であることを明らかにした。さらに、このドメインを含むC-末端鎖ペプチドをGFP融合タンパクとして作成し、蛍光抗体法により細胞観察を行うことにより、20アミノ酸残基を含むC-末端鎖ドメインが小胞体に移行することを確認した。
3.翻訳後ターゲティングに関与する分子シャペロンの検索:
GST融合タンパクを用いたpull-down assay法により、ラット好塩基球細胞株RBL-2H3の細胞質から、HDCのC-末端鎖ドメインに結合する2種類のタンパク質(分子量70kDaおよび60kDa)を見出した。さらに、HDCのC末端鎖ペプチドから小胞体移行シグナルである20アミノ酸残基を除くと、上記2種類のタンパク質の示す結合活性は消失することを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Hasegawa, H., et al.: "Opposite Regulation of Transepithelial Electrical Resistance and Paracellular Permeability by Rho in Madin-Darby Canine Kidney Cells"J. Biol. Chem.. 274・30. 20982-20988 (1999)
• [文献書誌] Suzuki, S., et al.: "Membrane targeting and binding of the 74-kDa form of mouse L-histidine decarboxylase via its carboxyl-terminal sequence"FEBS Lett.. 437. 44-48 (1998)
• [文献書誌] Ohuchi, Y., et al.: "Induction of histidine decarboxylase in type 2 T helper lymphocytes treated with anti-CD3 antibody"Inflamm. Res.. 47・1. S48-S49 (1998)
• [文献書誌] Ichikawa, A., et al.: "Benzamidine-sensitive proteinase in activated cleavage of recombinant 74kDa histidine decarboxylase into its 53kDa form in mastocytoma cells"Inflamm. Res.. 47・1. S46-S47 (1998)
• [文献書誌] Tanaka, S., et al.: "Intracellurlar Localization of the 74- and 53-kDa Forms of L-Histidine Decarboxylase in a Rat Basophilic/Mast Cell Line, RBL-2H3"J. Biol. Chem.. 273・14. 8177-8182 (1998)