蛍光エネルギー移動測定による分子モーターミオシンのエネルギー変換機構の研究

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11156212
• 研究機関: 福井大学
• 研究代表者: 三木 正雄 福井大学, 工学部, 教授 (30242580)
• キーワード: 蛍光エネルギー移動 / 分子モーター / ミオシン / アクチン

研究概要

本プロジェクトはモータータンパク質であるミオシンが、ATPを加水分解してその化学エネルギーをアクチンと相互作用してどのように力学エネルギーに変換するかを明らかにする為、蛍光エネルギー移動測定によってミオシン上の特異的な2つの部位間の距離を測定し、それがミオシンの生理機能に対応してどのように距離を変化させるかを調べることによって、構造的な情報を得ることであったが、現在のところは大きな変化をする特異的な部位間はみいだせていない。この研究は継続中である。一方、蛍光エネルギー移動測定によって、ATPを加水分解して力を発生する時のアクチンとミオシンとの相互作用の構造に基づいた情報を得る為、ミオシンS1の50KDaのlower domainにあり、又アクチン結合部位近くであるLys-533または、20KDaにあるSH1(Cysteine-707)に、それぞれ蛍光色素を結合させたミオシンS1を調製した。更にアクチンのGln-41やLys-61あるいは、Cys-374にそれぞれ蛍光色素を結合させた。これらミオシンS1とアクチンのそれぞれの色素間の距離を、定常励起光による蛍光エネルギー移動測定によって測定した。一方今年度に新たに導入したストップトフロー吸光蛍光分光計によって、まずアクチンとミオシン複合体がATP添加により解離していくキネテックスを吸光度の変化より追跡した。今後は、上記蛍光色素をラベルしたミオシンとアクチンを使って、それらの間のエネルギー移動測定をミリ秒時間分割測定することにより、それらの多くの部位間の距離測定から多面的に調べることによって、ミオシンモ一夕ーのアクチン上での動きを明らかにしていきたい。

研究成果

• [文献書誌] Miki, M. et al.: "Ca^<2+>-induced distance change between points on actin and troponin in skeletal muscle thin filaments estimated by fluorescence energy transfer spectroscopy"J. Biochem.. 123. 324-331 (1998)
• [文献書誌] Miki, M. et al.: "Fluorescence resonance energy transfer between points on tropomyosin and actin in skeletal muscle thin filaments : Does tropomyosin move?"J. Biochem.. 123. 1104-1111 (1998)
• [文献書誌] Hai, H. et al.: "Conformational Changes of the troponin-tropomyosin complex on F-actin observed by fluorescence resonance energy transfer measurements"J. Fluorescence. (in press). (2000)
• [文献書誌] Miki, M.: "Structural changes between regulatory proteins and actin : A regulation model by tropomyosin-troponin based on FRET measurements. in Molecular Interactions of Actin (dos Remedios, C. G. and Thomas, D. D., eds)"Springer Verlag, Heidelberg (in press). (2000)