植物の多細胞システム構築の基盤となる細胞分裂の制御機構

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11163217
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 新名 惇彦 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (30029235)
• 研究分担者: 加藤 晃 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (80283935) ; 関根 政実 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (70226653) ; 吉田 和哉 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (50252622)
• キーワード: 細胞周期 / サイクリン / Cdc2 / Rb / G1 / S期制御 / 細胞分裂 / 分化 / キナーゼ活性

研究概要

まずタバコ培養細胞をアフィディコリンとプロピザマイドによりG2/M期に同調化して、経時的にサイクリンD抗体により免疫沈降した画分を用いてタバコRbタンパク質を基質にキナーゼ活性を検出した。その結果、Rdタンパク質に対するキナーゼ活性がG1期中期以降に上昇することがわかった。一方、サイクリンA抗体により免疫沈降した画分ではヒストンH1に対するキナーゼ活性は検出されたが、タバコRbタンパク質に対するキナーゼ活性は検出されなかった。この結果は植物由来のRbタンパク質をリン酸化するRbキナーゼの実体を初めて証明したことになり、今後植物のG1/S期の制御機構を理解する上で貴重な知見である。
次に、タバコサイクリンDにGFP(green florescent protein)を融合させて、細胞内局在性を観察した。その結果、野生型のサイクリンDと融合したGFPは主に核に局在するが、リン酸化部位の変異体では核に局在しないことが分かった。この結果によりタバコサイクリンDの核局在性にサイクリンDのリン酸化が関与していることが分かった。また、この変異体をバキュロウイルス発現系により解析した結果、Cdc2aと結合するにもかかわらず、ヒストンH1キナーゼ活性がかなり低下したことより、サイクリンDのリン酸化はキナーゼ活性にも関与していることが分かった。なお、GFP融合サイクリンDがin vivoで機能していることを証明するため、GFP抗体を用いた免疫沈降により、4種のサイクリンDがCdc2aと複合体を形成してヒストンH1キナーゼ活性を示すことを証明した。また、レーザースキャニングサイトメトリーによりDNAの相対量を解析したところ、これらの形質転換体の中で、G1期の細胞の割合が減少してS期の細胞が増加するものが認められ、サイクリンDの高発現によりG1期が短縮する可能性が示唆された。

研究成果

• [文献書誌] Nakagami H,Sekine M,Murakami H,Shinmyo A: "Tabacco retinoblastoma-related protein phosphorylated by a distinct cyclin-dependent kinase complex with Cdc2/cyclin D in vitro"Plant J.. 18(3). 243-252 (1999)
• [文献書誌] Sekine M,Ito M,Uemukai K,Maeda Y,Nakagami H,Shinmyo A.: "Isolation and characterization of the E2F-like gene in plants"FEBS Lett.. 460(1). 117-122 (1999)
• [文献書誌] Y.Nakano,N.Steward,M.Sekine,T.Kusano and H.Sono: "A Tabacco cDNA ,NtMET1,Encoding a DNA Methyltransferase:Molecular Characterization and Abnormal Phenotypes of Transgenic Tabacco Plants"PCP(Plant & Cell Physioligy). (in press). (2000)
• [文献書誌] 奈良先端科学技術大学院大学・バイオサイエンス研究科 植物系全教員: "植物分子生理学入門"株式会社学会出版センター. 268 (1999)