酵素免疫測定法の高感度化を目的とした酵素反応シンクロナイゼーション系の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11167248
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• キーワード: 酵素免疫測定法 / 抗原抗体反応 / 分子シンクロナイゼーション / 臨床分析 / 酸化還元反応 / アルカリホスファターゼ / テトラゾリウム / C反応性蛋白質

研究概要

酵素免疫測定法にカップルして、検出感度を増幅できる3酵素シンクロナイゼーション系の開発を検討した。alkaline phosphatase(ALP),alcohol dehydrogenase(ADH),diaphorase(DIA)の3酵素が効率よく作用するための条件を最適化した。DIAは不安定であり、適用できる温度、pH条件が狭いため、DIAの代わりに電子メディエータPMSを用いて再検討したところ、DIAより安価で、安定した触媒活性が得られた。DIAおよびPMSの基質としては、従来、INT(不溶性テトラゾリウム)が使用してきたが、不溶性の生成物フォルマザンが感度低下をもたらすため、今回、可溶性テトラゾリウム(WST-1)に変更した。WST-1を用いることにより、反応時間は30分から200分までのばすことができた。また、ALPの基質であるNADP+中に約0.1%のNAD+の混入が認められ、このことがバックグラウンドの原因となることが示された。HPLCによりNADP+を精製したところ、バックグラウンドを1/10に低減させることができた。ヒトのC反応性蛋白質(CRP)を抗原とするサンドイッチ酵素免疫測定法に、今回開発したシンクロナイゼーション系をカップルさせたCRP検出系を開発した。60分の反応で、50attomoleのCRPが検出可能であることが示された。本検出感度は臨床的に充分適用可能な感度である。p-ニトロフェニルホスフェートを基質とする従来法(1酵素系)に比べて、1000倍以上高感度であった。今後、ADH中にコンタミしているALPを除去することにより、より高感度化が期待される。

研究成果

• [文献書誌] H.Oneda and K.Inouye: "Interaction of human matrix metalloproteinase 7(matrilysin) with the inhibitors, thiorphan…"J.Biochem.. 129. 429-435 (2001)
• [文献書誌] K.Inouye and S.Ohnaka: "Pepsin digestion of mouse monoclonal antibody of IgG1 class formed F(ab')_2…"J.Biochem.Biophys.Methods. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] S.Okumura,S.Akao K.Inouye 他2名: "Screening of the Bacills thuringiensis Cryl Ac δ-endotoxin on the…"J.Biochem.Biophys.Methods. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] K.Inouye,,S.Kondo,M.Yamamura 他2名: "Inhibitory effects of detergents on rat CYP1A1-dependent monooxygenase."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] K.Inouye,T.mizokawa, A.Saito 他3名: "Biphasic kinetic behavior of rat cytochrome P450 1A1-dependent monooxygenation…"Biochim.Biophys.Acta. 1481・2. 265-272 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki and K.Inouye: "Practical application of mammalian cytochrome P450"J.Biosci.Biotechnol.. 90. 583-590 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye,A.Saito,M.Onita 他3名: "inhibitory effects of 1,4-naphthoquinones on rat cytochrome P450 1A1-dependent…"J.Biochem.. 127・6. 1041-1046 (2000)
• [文献書誌] H.Oneda and K.Inouye : "Effects of dimethyl sulfoxide, temperature, and sodium chloride on the activity…"J.Biochem.. 128・5. 785-791 (2000)
• [文献書誌] N.Sawada,T.Sakaki,K.Inouye 他1名: "Metabolism of vitamin D3 by human CYP27A1"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 273・3. 977-984 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye,H.Tanaka, and H.Oneda: "States of tryptophyl residues and stability of recombinant human matrix…"J.Biochem.. 128・3. 363-369 (2000)
• [文献書誌] T.Takita,N.Shimizu,K.Inouye 他7名: "Lysyl tRNA synthetase of Bacillus stearo-thermoplilus."Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・2. 432-437 (2000)
• [文献書誌] K.Hayashi,T.Sakaki,K.Inouye 他2名: "Coexpression of genetically engineered of used enzymes between yeast NADPM-P450 reductase…"Arch.Biochem.Biophys.. 381・1. 164-170 (2000)
• [文献書誌] K.Morimoto and K.Inouye: "Application of Bispecific F(ab')2μ fragments prepared from Igms against CEA…"Clin.Chem.. 46. 1492-1493 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki,N.Sawada,K.Komai,K.Inouye 他4名: "Dual metabolic pathways of 25-hydroxy vitamin D3 cytalyzed by human CYP24"Eur.J.Biochem.. 267. 6158-6165 (2000)
• [文献書誌] 榊利之,井上國世: "ビタミンD24-水酸化酵素の生理作用"季刊 腎と骨代謝. 13・2. 129-135 (2000)
• [文献書誌] 井上國世,滝田禎亮,永井宏平: "プロテアーゼによる分離大豆たん白質の凝集反応の考察"大豆たん白質研究. 3. 22-28 (2000)
• [文献書誌] K.Inouye and T.Sakaki: "Enzymatic studies on the Key enzyems fo vitamin D metabolism."Biotechnol.Ann.Rev.. 7. 179-194 (2001)
• [文献書誌] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology (J.R.Whitaker 他3名編)"Mercel Dekker, New York(印刷中). (2001)
• [文献書誌] N.Sawada,T.Sakaki, K.Inouye 他3名: "Molecular Steroidogenesis (M.Okamoto, Y.Ishimura and H.Nawata 編)"Universal Academy Press, Tokyo. 442 (2000)
• [文献書誌] T.Sakaki,N.Sawanda,K.Inouye 他2名: "Molecular Steroidogensis (M.Okamoto, Y.Ishimura,and H.Nawata編)"Universal Academy Press, Tokyo. 442 (2000)
• [文献書誌] 井上國世: "動物細胞工学ハンドブック"朝倉書店. 362 (2000)
• [文献書誌] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2001)