シグナル伝達機構解析を目指した抗体-受容体キメラ蛋白質の創製と構造解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11169203
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 熊谷 泉 東北大学, 大学院・工学研究科, 教授 (10161689)
• 研究分担者: 津本 浩平 東北大学, 大学院・工学研究科, 助手 (90271866)
• キーワード: 抗体-受容体キメラ蛋白質 / エリスロポエチン受容体 / X線結晶構造解析 / 卷き戻し系 / 分子認識 / 抗原抗体相互作用 / 不溶性顆粒

研究概要

本研究は、シグナル伝達における蛋白質複合体の詳細な構造・機能解析を目指して、以下の2点を目指している。(1)抗ニワロリリゾチーム抗体HyHEL10Fv-エリスロポエチン受容体キメラ蛋白質を受容体のリガンド認識機構研究のモデルケースと捉え、HyHEL10Fv-受容体キメラ蛋白質と抗原リゾチームとの複合体のX線結晶解析を行う。(2)異種抗原認識能を有するHyHEL10Fv変異体を用いて細胞増殖能の変化を調べ、さらに変異HyHEL10Fv-受容体キメラ蛋白質とリガンド複合体の構造解析を行い、分子認識能と細胞表面からの情報伝達の機構に迫る。今年度の実績は以下の通りである。(1)前年度構築したヒト並びにマウス由来のエリスロポエチン受容体について、その細胞外ドメイン遺伝子をクローニングし、大腸菌を用いた高発現系並びに抗体分子に準じた、不溶性顆粒からの高効率な巻き戻し系を用いて、結晶構造解析を初めとする各種物理化学的解析に十分対応できる試料を調製し、マウス由来受容体については得られた試料を用いた結晶化条件の検討をより詳細に行った。また、変異体を作製し、等温滴定型熱量測定、表面プラスモン共鳴を用いて、高親和性ペプチド並びにエリスロポエチンを用いて相互作用を詳細に解析した。(2)前年度構造解析を行ったFv変異体と受容体のキメラ蛋白質について、前年度構築した発現系を用いて、卷き戻し系を構築し、結晶構造解析を初めとする各種物理化学的解析に十分対応できる試料を調製し、各種物理化学的解析を行う。(3)既に確立してあるFvとニワトリリソチームとの複合体の結晶化条件をもとに、抗体-受容体キメラ蛋白質の構造機能解析において用いる変異抗体について、抗原との複合体の結晶を引き続き作製し、高エネルギー加速器研究機構の放射光装置で精密なデータ収集を行い、相互作用について詳細な考察を行った。

研究成果

• [文献書誌] Nishimiya et al.: "Thermodynamic consequences of grafting enhanced affinity toward a mutated antigen onto an antibody : The case of anti-hen lysozyme antibody.HyHEL-10"The Journal of Biological Chemistry. 275. 12813-12820 (2000)
• [文献書誌] Asano et al.: "Functional construction of anti-mucin core protein (MUCl) antibody MUSEII variable regions in a bacterial expression system"The Journal of Biochemistry. 127. 673-679 (2000)
• [文献書誌] Arai et al.: "Fluorolabeling of antibody variable domains with green fluorescent protein variants : Application to an energy transfer-based homogeneous immunoassay"Protein Engineering. 13. 369-373 (2000)
• [文献書誌] Ueno et al.: "Monoclonal antibody-mediated inhibition of hepatitis C virus NS3 protease : Probing NS4A-induced conformational change at protease active site."Journal of Virology. 74. 6300-6308 (2000)
• [文献書誌] Takemura et al.: "Functional Fv fragment of an antibody specific for CD28 : Fv-mediated costimutation of T cells "FEBS Letters. 476. 266-271 (2000)
• [文献書誌] Ueda et al.: "Cell-growth control by monomeric antigen : the cell surface expression of lysozyme-specific Ig V-domains fused to truncated EPO receptor."Journal of Immunological Methods. 241. 159-170 (2000)
• [文献書誌] Tsumoto and Kumagai: "Thermodynamic consequences of single-mutation on association of an antibody with its specific antigen : The case of anti-hen lysozyme antibody, HyHEL-10"Chemistry Letters. 1066-1067 (2000)
• [文献書誌] Takemura et al.: "Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system"Protein Engineering. 13. 583-588 (2000)
• [文献書誌] Yoda et al.: "Folding-unfolding of goat alpha-lactalbumin studied by stopped-flow CD and molecular dynamic simulations"Proteins ; Struct.Funct.Genet.. 42. 49-65 (2001)
• [文献書誌] Arai et al.: "Demonstration of a homogeneous noncompetitive immunoassay based on bioluminescence resonance energy transfer"Analytical Biochemistry. 289. 77-81 (2001)
• [文献書誌] Nakamura et al.: "Panning of phage VH library using nitrocellulose membranes-application to selection of human VH library"The Journal of Biochemistry. 129. 209-212 (2001)
• [文献書誌] Kasai et al.: "Fv fragment of an antibody specific for hepatitis C NS3 protease domain : The sequence analysis, bacterial expression, and functional characterization."Biochem.Biophys.Res.Commun.. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] 津本ら: "抗体ドメインの効率的な巻き戻し法"生物物理. 40. 274-276 (2000)
• [文献書誌] 津本ら: "変異体を用いた抗原抗体相互作用の熱力学的、速度論的解析"人工知能学会KBS研究会. 49. 83-88 (2000)
• [文献書誌] 熊谷,津本: "金属表面特異的ペプチドの選択-半導体と生命分子の接点"化学. 55. 58-59 (2000)
• [文献書誌] 津本 ら: "不溶性顆粒からの蛋白質の巻き戻し"蛋白質核酸酵素. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] 津本,熊谷: "ファージディスプレーを用いた新規バイオ分子の選択と応用"BIOINDUSTRY. (印刷中). (2001)
• [文献書誌] 熊谷,津本: "ファージライブラリーによる抗体産生"文光堂. 180 (2000)
• [文献書誌] 熊谷,金谷 ら: "生命工学"共立出版. 350 (2000)
• [文献書誌] Kumagai and Tsumoto: "Encyclopedia of Life Sciences"Blackwell(印刷中). (2001)
• [文献書誌] 津本,熊谷: "生体ナノマシンの分子設計"共立出版(印刷中). (2001)
• [文献書誌] 津本: "抗体工学(生命工学)"共立出版. 50 (2000)