大腸菌呼吸鎖電子伝達酵素複合体の構造生物学による全体像の解明

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11169209
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 茂木 立志 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90219965)
• キーワード: 大腸菌 / 呼吸鎖 / 酵素複合体 / 末端酸化酵素 / ユビキノン / FTIR / 膜結合型マシーナリー / コハク酸水素酵素

研究概要

大腸菌細胞膜は、好気的呼吸鎖電子伝達系のNADH脱水素酵素、コハク酸脱水素酵素(SDH)、2種類の末端酸化酵素(チトクロムboおよびbd型ユビキノール酸化酵素)を過剰発現させる系がそれぞれ確立されており、「膜結合型マシーナリー」研究の優れた材料である。本年度は、SDHをポリオキシエチレン系のC_<12>E_8で、末端酸化酵素をオクチルチオグルコシドまたはシュクロースモノラウレートで可溶化し陰イオン交換HPLCで精製する従来の手法を改良しグリセロール密度平衡遠心法およびヒドロキシアパタイトHPLCによって無傷の複合体純度を向上させることが可能になった。次年度は、構造生物学的研究に発展させるため、これらの標品を用いた結晶化条件の検討を行なう。また、結晶構造からは同定できない低親和性基質酸化部位の構造特性を、基質アナログ耐性変異、^<13>C-ユビキノン2や阻害剤aurachinCアナログの結合反応、チトクロムc酸化酵素とのドメインキメラの解析によって、チトクロムboを用いて明らかにした。更に、各酵素複合体の固有な立体構造と特異機能を対応付けるため、末端酸化酵素の酸素分子還元部位へのシアン、アザイド、ふっ素の結合機作を解析し、パルスラジオリシス法やフローフラッシュ法などの過渡吸収法を用いて分子内電子移動を明らかにした。反応中心の動態に関しては、末端酸化酵素の酸化型から完全還元型への変換過程での酵素タンパク質の微細構造変化をアミノ酸置換変異体や^<13>C-Tyr標識酵素などを用いて明らかにした反応過程の連続的な追跡は、新たに開発した分子内電荷移動を時間分解測定できる実験系や時間分解FTIR分光器の適用によって可能となった。

研究成果

• [文献書誌] H. Miyoshi: "Characterization of the ubiquinol oxidation sites in cytochromes bo and bd from Escherichia coli using aurachin C analogues"J. Biochem.. 125. 138-142 (1999)
• [文献書誌] E. Muneyuki: "Time-resolved measurements of photovoltage generation by bacteriorhodopsin and halorhodopsin adsorbed on a thin polymer film"J. Biochem.. 125. 270-276 (1999)
• [文献書誌] Y. Yamazaki: "Fourier-transform infrared studies on conformational changes of bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli upon photoreduction of the redox metal centers"J. Biochem.. 125. 1131-1136 (1999)
• [文献書誌] M. Tsubaki: "Fluoride-binding to the Escherichia coil bd-type ubiquinol oxidase studied by visible absorption and EPR spectroscopies"J. Biochem.. 126. 98-103 (1999)
• [文献書誌] Y. Yamazaki: "Effects of amino substitutions on redox-induced conformational changes of the Escherichia coli o-type ubiquinol revealed by Fourier-transform infrared spectroscopy"J. Biochem.. 126. 194-199 (1999)
• [文献書誌] M. Tsubaki: "Azide- and cyanide-bindings to the Escherichia coli bd-type ubiquinol oxidase studied by visible absorption, EPR and FTIR spectroscopies"J. Biochem.. 126. 510-519 (1999)
• [文献書誌] K. Sakamoto: "Defining structural domain of subunit II of the heme-copper terminal oxidase using chimeric enzymes from the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase and the thermophilic Bacillus caa_3-type cytochrome c oxidase"FEBS Lett.. 126. 934-939 (1999)
• [文献書誌] M. Tsubaki: "Fourier-transform infrared studies on azide binding to the binuclear center of the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase"FEBS Lett.. 449. 191-195 (4999)
• [文献書誌] T. Mogi: "Role of a bound ubiquinone on reactions of the Escherichia coli cytochrome bo with ubiquinol and dioxygen"FEBS Lett.. 457. 61-64 (1999)
• [文献書誌] K. Kobayashi: "Pulse radiolysis studies on electron transfer processes in cytochrome bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli"Biochemistry. 38. 5913-5917 (1999)
• [文献書誌] P. Hellwig: "The vibrational modes of ubiquinone in cytochrome bo_3 identified by FTIR difference spectroscopy and specific ^<13>C labeling"Biochemistry. 38. 14683-14689 (1999)
• [文献書誌] 茂木立志: "バクテリオロドプシンの結晶構造とプロトン輸送機構"蛋白質核酸酵素. 41. 51-56 (1999)
• [文献書誌] 茂木立志: "オキシダーゼ:酸素呼吸を支える分子装置の分子進化と作動機構"ニューバイオフィジックス、第3巻イオンポンプとトランスポーター(平田肇、茂木立志編)、共立出版. 3(印刷中). (2000)