集合系マシーナリーとしての微生物の芳香環分解代謝系の構造生物学

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11169215
• 研究機関: 長岡技術科学大学
• 研究代表者: 野中 孝昌 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (30242457)
• 研究分担者: 政井 英司 長岡技術科学大学, 工学部, 助教授 (20272867) ; 福田 雅夫 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (20134512)
• キーワード: 転写調節因子 / LysRファミリー / X線結晶構造解析 / 反応機構 / 誘導物質 / 酸化ストレス反応 / システイン生合成 / 蛋白質

研究概要

多波長異常分散法によりCbnRの構造解析を行うため、大腸菌を用いてセレノメチオニン置換体のCbnRを大量発現させ、精製を行った。ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて、セレノメチオニン置換体のCbnRの結晶を得た。その結晶の空間群はP2_12_12で、格子定数はa=71.22Å, b=100.87Å, c=87.73Åであった(form I)。また、空間群P2_12_12_1、格子定数a=65.27Å, b=124.47Å, c=166.81Å(form II)と空間群P2_12_12、格子定数a=64.51Å、b=149.14Å, c=60.52Å(form III)の結晶も得られた。多波長異常分散法によりform I結晶からCbnRの位相を決定し、その後得られた2.2Åの高分解能回折データを用いて結晶学的精密化を行った。最終的にR=0.22、R_<free>=0.25の結晶構造を得た。そして、form I CbnRの調節ドメインの原子座標を用いて、分子置換法によりform IIとIIIのCbdRの結晶構造を決定した。CbnRの結晶構造は、LTTR(LysR-type transcriptional regulator)で初めて明らかにされた全長構造の立体構造である。その立体構造は、N末端側のDNA結合ドメインとC末端側の調節ドメインが29残基のアミノ酸からなる長いα-helix(linker belix)でつながれていた。CbnRのDNA結合モチーフは、Winged belix-turn-helixモチーフに分類されることがわかった。CbnRの調節ドメインの立体構造はCysBとOxyRのものと類似しており、α/β構造を持つサブドメイン2つで構成されていた。

研究成果

• [文献書誌] Sato, N., Uragami, Y., Nishizaki, T., Takahashi, Y., Sazaki, G., Sugimoto, K., Nonaka, T., Masai, E., Fukuda, M., Senda, T.: "Crystal structures of the reaction intermediate and its homologue of an extradiol-cleaving catecholic dioxygenase"Journal of Molecular Biology. 321(4). 621-636 (2002)
• [文献書誌] Muraoka, S., Okumura, R., Uragami, Y., Nonaka, T., Ogawa, N., Miyashita, K, Senda, T.: "Purification and crystallization of a LysR-type transcriptional regulator CbnR from Ralstonia Eutropha NH9"Protein and Peptide Letters. 10(in press). (2003)
• [文献書誌] Muraoka, S., Okumura, R., Ogawa, N., Nonaka, T., Miyashita, K., Senda, T.: "Crystal structure of a full-length LysR-type transcriptional regulator, CbnR : unusual combination of two subunit forms and molecular bases for causing and changing DNA bend"Journal of Molecular Biology. (in press). (2003)