造血幹細胞から巨核球への分化に関わる蛋白質群の3次元構造と機能

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11169226
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 山縣 ゆり子 大阪大学, 薬学研究科, 助教授 (40183678)
• 研究分担者: 土井 健史 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (00211409)
• キーワード: 巨核球分化 / 蛋白質の大量生産 / トロンボポエチン刺激 / 蛋白質の結晶化 / 蛋白質の細胞内局在

研究概要

血液中に存在する種々の血球は骨髄の造血幹細胞から分化する。その中でも血小板の前駆細胞である巨核球への分化、成熟の分子機構は、最もわかっていない研究領域である。本研究の目的は、当分野土井らにより発見された巨核球への分化の過程で産生される一連の蛋白質群の結晶化、X線結晶構造解析を行い、蛋白質の3次元構造から、巨核球への分化に関わる蛋白質-蛋白質相互作用機構の解明に貢献することである。
今年度は、特にトロンボポエチンの刺激に応答し、未分化な造血系組織に特異的に産生され、シグナル伝達系によく見られるリン酸化可能な配列を多くもち、巨核球への分化のシグナル伝達に重要な役割を果たしていると推定される分子量約13万の全長蛋白質(DRF(Differen tian Responsive Factor)-1と名付けた)の大量調製、結晶化を目標とした。まず、HEL(DMSO)cDNAからPCRによりDRF-1遺伝子をクローニング、大腸菌発現用ベクターPET28aにサブクローニングした。次に、DRF-1-PET28aを大腸菌BL21(DE3)-RILに導入し、大量発現の条件検討を行ったところ、25℃での培養で大量発現に成功した。また発現した蛋白質の同定は抗体を用いたWestern Blottingで行った。現在、精製方法の検討を行っているが、溶解性が低いため、この対処法を主に検討している。
さらにDRF-1の機能解明の一環として、真核細胞(COS7)内でのDRF-1の分布を間接蛍光抗体法により蛍光顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡で調べたところ、多くは細胞質に局在していたが、一部は核にも存在することが観察されたので、細胞周期等によって局在が変化する可能性も示唆される。

研究成果

• [文献書誌] Kazufumi Takano: "Contribution of Hydrogen Bonds to the Conformational Stability of Human Lysozyme : Calorimetry and X-ray Analysis of Six Serine -> Alanine Mutants"Biochemistry. 38. 6623-6629 (1999)
• [文献書誌] Kazufumi Takano: "Experimental Verification of the 'Stability Profile of Mutant Protein' (SPMP) Data Using Mutant Human Lysozymes"Protein Engineering. 12. 663-672 (1999)
• [文献書誌] Kazufumi Takano: "Contribution of Intra- and Intermolecular Hydrogen Bonds to the Conformational Stability of Human Lysozyme"Biochemistry. 38. 12698-12708 (1999)
• [文献書誌] Jun Funahashi: "Contribution of Amino Acid Substitutions at Two Different Interior Positions to the Stability of Human Lysozyme"Protein Engineering. 12. 841-850 (1999)
• [文献書誌] Kazufumi Takano: "Effect of Foreign N-terminal Residues on the Conformational Stability of Human Lysozyme"Eur. J. Biochem.. 266. 675-682 (1999)
• [文献書誌] Shuichiro Goda: "Amyloid Protofilament Formation of Hen Egg Lysozyme in Highly Concentrated Ethanol Solution"Protein Science. 9. 381-388 (2000)