プロテアーゼと質量分析を組み合わせた結晶化の為のコア構造探索システムの確立

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11169238
• 研究機関: 藤田保健衛生大学
• 研究代表者: 谷口 寿章 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助教授 (10257636)
• 研究分担者: 松原 守 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助手 (90288481) ; 千谷 晃一 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 教授 (60179942)
• キーワード: 質量分析 / 立体構造 / 結晶化 / 結晶化支援 / 自動化 / 蛋白質 / プロテアーゼ

研究概要

蛋白質複合体の効率よい結晶化を目指す為には、結晶化しやすいコア構造を見出すことが早道であることは言うまでもない。コア構造を蛋白質の一時構造などからアプリオリを見出すことは困難であるが、幸いにしてプロテアーゼによる限定分解で分解されやすい部位と結晶化を妨げるフレキシブルなドメインとの間、及び分解を受けない部位と結晶化し易いコア構造との間には良い相関が見られる。本研究においては、プロテアーゼ処理とコア構造の質量分析による迅速同定法を組み合わせた、結晶化しやすいコア構造の組織的探索法の開発を目的とする。本年度は、質量分析法、特にMALDI-TOFを用いた、蛋白質の迅速同定法の開発を行った。プロテアーゼ処理により得られた大量の試料の同定を行うためには、多くの試料を脱塩し、さらにMALDI-TOFのターゲットにマトリックスと混合、塗布する必要がある。このステップをロボットにより自動化し、さらに測定後の得られた分子量データを用いた断片の同定をコンピューター上でシークエンス情報とたい自動的に行うシステムを確立した。分子量1万を超える断片の場合には、分子量から一義的に同定することが不可能な場合があるが、この場合にはエレクトロスプレー質量分析計を用いたタンデムマス法を併用することで、同定をより確実なものとした。これらのシステムを用い、MARCKS蛋白質とカルモジュリン複合体、及び、NAP-22蛋白質とカルモジュリン複合体の結晶化に適した試料作成に応用し、結晶化に成功した。今後は、使用するプロテアーゼの種類、量、反応時間を自動制御し、効率よくコア構造を探索するシステムの確立を目指す。

研究成果

• [文献書誌] Uedaira,H.,et al.: "Domain organization of flagellar hook protein from salmonella typhimurium"FEBS Leet.B. 421. 203-207 (1999)
• [文献書誌] Takasaki,A.,et al.: "Identification of the calmodulin-binding domain of neuron-specific protein kinase C substrate protein CAP-23/NAP-22:Direct involvement of protein myristoylation in calmodulin-target protein interaction"J.Biol.Chem.. 274. 11848-11853 (1999)
• [文献書誌] Manenti,S.,et al.: "Phosohprylation of the myristoylated PKC substrate MARCKS by the cyclin E-Cdk2 complex in vitro"Biochem.J.. 340. 775-782 (1999)
• [文献書誌] Tniguchi,H.: "Protein myristoylation in protein-lipid and protein-protein interactions(Review)"Biophys.chem.. 82. 129-137 (1999)
• [文献書誌] 谷口 寿章: "質量分析のタンパク質構造解析への応用とプロテオーム解析"実験医学. 17. 2550-2554 (1999)
• [文献書誌] Yamauchi,E.and Taniguchi,H.: "Neural development(Uemura,K.Kawamura,K.and Yazaki,T.,eds)"Springer-Verlag,Tokyo.. 416-420 (1999)
• [文献書誌] Yamauchi,E.,et al.: "Neural development(Uemura,K.Kawamura,K.and Yazaki,T.,eds)"Springer-Verlag,Tokyo.. 421-424 (1999)