皮質ニューロン内遺伝子発現の単一分子レベル計測開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11170201
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 金城 政孝 北海道大学, 電子科学研究所, 助教授 (70177971)
• 研究分担者: 野村 保友 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (80237883)
• キーワード: c-fos / PCR / 蛍光測定 / 蛍光相関分光法 / 遺伝子発現 / 単一分子検出 / 低酸素 / 近赤外分光法

研究概要

本研究は光学的手法を用いることで、生きたまま活動している脳表面における各単一細胞の遺伝子発現の過程、特に低酸素・低エネルギー状態で発現するc-fos mRNAを検出するための手法の開発と発現機構の解明を行うことを目的とした。
まず我々は溶液中の極微小領域(fL,10-15L以下)を出入りする蛍光分子の並進拡散速度変化を利用する蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)を用いて、特定遺伝子の発現を単一分子レベルで検出する手法の確立を目指した。
この手法を脳表面への測定へ応用するために我々は成立顕微鏡タイプのFCSを開発した。現在の問題点は検出器を顕微鏡本体上部に設置すると、機械的強度が保てなくなる点である。これを改善するために検出器と顕微鏡の間のシグナルを光ファイバーで結び、改良を加えた。
また、一方、脳スライスにおける内因性光学シグナルは細胞の体積変化を反映する。2光子共焦点顕微鏡を用いてカルセインで染色した細胞を観察すると、高カリウムに対してデンドライトは影響されなかったが、グリアのプロセスの直径は1.2倍に増加した。これらの結果から高カリウムによる内因性シグナルにはNKCClの活性化を介したグリアの膨潤が寄与していると考えられた。現在、この細胞の体積変化が「水」を直接取り込むことによるのならば、細胞内の粘性の変化に伴うカルセインの動きの変化が起こると想定される。その変化を単一細胞レベルで測定することで試作した装置の性能を評価できるものと考えて今後研究をすすめるよていである。

研究成果

• [文献書誌] Nomura,Y.: "Monitoring of in vivo and in vitro translation of green fluorescence protein and its fusion proteins by fluorescence correlation spectroscopy."Cytometry.. 44. (2001)
• [文献書誌] Yoshida,N: "Microenvironment of endosomal aqueous phase investigated by the mobility of microparticles using fluorescence correlation spectroscopy."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 280. 312-318 (2001)
• [文献書誌] Yoshida,N: "Fluorescence correlation spectroscopy : A new tool for probing the microenvironment of the internal space of organelles."Single Molecules.. 1. 279-283 (2001)
• [文献書誌] Terada,S: "Oligomeric tubulin in large transporting complex is transported via kinesin in squid giant axons."Cell. 103. 141-155 (2000)
• [文献書誌] 金城政孝: "ConfoCor:蛍光相関顕微鏡"細胞. 38. 254-258 (2000)
• [文献書誌] Pack,C-G: "Effect of electrostatic interaction on the binding of charged substrate to GroEL studies by high sensitive fluoresccence correlation spectroscopy."Biochem Biophysi Res Comm.. 267. 300-304 (2000)
• [文献書誌] 宮脇敦史: "GFPとバイオイメージング"羊土社. 276 (2000)