GFPを用いたFRETによる神経系細胞内における転写因子間相互作用の追跡

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11170245
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 西 真弓 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (40295639)
• 研究分担者: 森田 規之 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (50239662) ; 小澤 一史 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (60169290)
• キーワード: FRET / GFP / ステロイドホルモンレセプター / 蛋白-蛋白相互作用 / 生細胞 / リアルタイムイメージング / 共役転写因子 / 初代培養神経細胞

研究概要

ステロイドホルモンが神経系細胞の発生、分化、機能発現に際して様々な影響を及ぼすことが知られている。こうした作用の大部分は、転写制御因子であるステロイドホルモンレセプターを介した遺伝子発現制御に基づく。リガンド結合したステロイドホルモンレセブターは通常ホモダイマーを形成して基本転写装置とともに巨大な複合体を染色体上に構築するが、この際ステロイドホルモンレセプターと基本転写装置との間を介在するいわゆる転写共役因子(cofactor)の存在が必須であることがわかってきた。神経系におけるステロイドホルモン作用の解明にはステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子の相互作用の機構ならび゛に異なるステロイドホルモンレセプター間のヘテロダイマー形成の可能性を検索するとともに、その作用発現の場を調節する機構を細胞種特異的にダイナミックに検索していく必要がある。こうした蛋白-蛋白相互作用の解析に、近年two hybrid systemが用いられているが、疑陽性例が非常に多いなど未だ課題が山積している。本研究は、ステロイドホルモンレセプターおよび転写共役因子、あるいは異なるステロイドホルモンレセプター同士がリガンドの添加や様々な細胞外環境の変化に対して細胞内でどのような相互作用を示すのかを、蛍光のエネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer;FRET)を利用して生細胞内でリアルタイムにイメージングして解析する系の確立を目的とした。Estrogen receptor(ER)αをCFPで、転写共役因子のSBC-1(steroid receptor coactivator1)をYFPでそれぞれ標識し、あるいはERαおよびEBβをそれぞれCFPおよびYFPで標識し、COS細胞に共発現させ、種々の薬剤を投与してその相互作用をFRETにて解析した。FRET用あるいはdonor用の蛍光フィルターセットを用いて画像を取り込み、background処理を行った後、下記の式に従って蛍光強度の比をを求め、さらにGordonらの方法(Biophys J.74:2702-13(1998))により補正してFRET値を求めた。
Positive controlとしては、CFPとYFPをglycine3個でtandemに繋いだ融合タンパクを、一方、negative controlとしてはCFPおよびYFP単独を共発現させたものを用いた。
Ratio=(Intensity of FRET-background)/(Intensity of CFP-background)
FRET value=mean ratio(donor+acceptor)-(mean ratio(donor only))/mean ratio(donor only)
その結果、ERα-CFPとSBC-1-YFPとを共発現させた場合およびERα-CFPとERβ-YFPとを共発現させた場合、アゴニストの17-β-estradiolを投与後15-30分後において、対照のcorticosteroneの場合と比較してFRET値の上昇を認めた。今後は、その他のステロイドレセプターとSRC-1との相互作用なども含めて、初代培養神経細胞を用いて観察を進める予定である。さらに、FRETのみならず、FCCS(fluorescence cross correlation spectrography)のような新しい技術も取り入れてsingle cellかつreal timeで神経系における転写因子相互作用を解析していきたいと考える。

研究成果

• [文献書誌] Ogawa H.: "Localization of nuclear coactivators p300 and steroid receptor coactivator 1 in the rat hippocampus."Brain Res. 890. 197-202 (2001)
• [文献書誌] 西真弓: "コルチコステロイドレセプターとストレス"神経精神薬理. (In press).
• [文献書誌] Nishi M.: "Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons."Brain Res.. 868. 113-118 (2000)
• [文献書誌] Ito T.: "In vitro and in vivo immunohistochemistry for the distribution of mineralocorticoid receptor with specific antibody."Neurosci Res. 37. 173-182 (2000)
• [文献書誌] Yoshimoto K.: "Changes in dopamine transporter and c-Fos expression in the nucleus assumbens of alcohol-tolerant rats."Alcohol Clin Exp Res. 24. 361-365 (2000)
• [文献書誌] Maegawa Y.: "Effects of near-infrared low level laser irradiation on microcirculation."Lasers in Surgery and Medicine. 27. 427-437 (2000)
• [文献書誌] 河田光博: "転写因子としてのステロイドホルモンレセプターの細胞内動態とその生理的意味."自律神経. 37. 215-220 (2000)
• [文献書誌] Nishi M.: "Agonist and antagonist induced plasticity of rat 5-HT1A receptor in hippocampal cell culture."SYNAPSE. 31. 186-195 (1999)
• [文献書誌] Nishi M.: "Real-time imaging of glucocorticoid receptor dynamics in living neurons and glial cells in comparison with non-neural cells."Eur.J.Neurosci.. 11. 1927-1936 (1999)
• [文献書誌] Ozawa H.: "Down-regulation of ACTH and glucocorticoid receptor immunoreactivity in hypothalamic arcuate neurons after adrenalectomy in the rat."NeuroReport. 10. 1571-1575. (1999)
• [文献書誌] Kanemasa H.: "Disitribution of glucocorticoid receptor immunoeactivity in the gastric mucosa of normal and adrenalectomized rats."Digestive Disease and Science. 44. 2081-2087 (1999)
• [文献書誌] 河田光博: "組織細胞化学 GFPを用いた機能タンパクイメージング."学際企画(日本組織細胞化学 編)東京. 6 (2000)
• [文献書誌] 西真弓: "細胞内機能タンパクの局在・動態の可視化、ポストゲノム時代の実験講座シリーズ「GFPとバイオイメージンゲ〜原理・応用・検出のすべて〜」、"羊土社、東京. 8 (2000)
• [文献書誌] Kawata M.: "Imaging analysis of nuclear receptors of corticoids and estrogen in the brain.Molecular Steroidgenesis (Eds.Okamoto M., Ishimura Y., and Nawata H)"Universal Academy Press Inc., Tokyo, Japan. 4 (2000)