人工金属タンパク質の分子設計

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11228208
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 渡辺 芳人 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 教授 (10201245)
• 研究分担者: 小崎 紳一 山形大学, 教育学部, 助教授 (40280581) ; 小江 誠司 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (60290904) ; 上野 隆史 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 助手 (70332179)
• キーワード: ミオグロビン / カタラーゼ / ヘム酵素 / 活性酸素

研究概要

本年度の研究では、活性酸素の一種である過酸化水素の酸化的分解反応を触媒するカタラーゼ機能をミオグロビンに賦与することを目指し、ミオグロビンヘム周辺の分子設計を行った。特に、遠位ヒスチジンの位置を動かし、一般酸塩基触媒としての役割の検討を念頭に置いたミュータントを合成した。
こうして合成した一連のミオグロビンミュータントは、過酸などの酸化剤と反応してcompound Iと呼ばれるカタラーゼ反応の活性酸化種を与えた。ストップトフローを用いて、ミオグロビンミュータントのcompound Iと過酸化水素の反応を追跡したところ、それぞれに対して一次で反応が進行し、ミオグロビンは休止状態へと完全に変化した。この反応で発生する酸素分子は過酸に対して50%であり、18-Oでラベルして実験を行うと、スクランブルが起こらないことから、カタラーゼ反応を完全に再現していることが明らかになった。
次に、重水素で置換した過酸化水素(D_2O_2)を用いてカタラーゼ反応の素過程を検討した。上記の一般酸塩基触媒が適切に配置されているミュータントでは速度論的重水素効果が小さく(<2)、一般酸塩基触媒が作用しない系では非常に大きな重水素効果が得られた。この結果から、カタラーゼ反応は二つの機構が存在し、一般酸塩基触媒が働く場合にはイオン的機構、働かない場合にはラジカル機構で進行することが初めて明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] S.Ozaki, I.Hara, T.Matsui, Y.Watanabe: "Molecular Engineering of myoglobin : The Improvement of Oxidation Activity by Replacing Phe-43 with Tryptophan"Biochemistry. 40. 1044-1052 (2001)
• [文献書誌] H.Ohtsu, S.Itoh, S.Nagatomo, T.Kitagawa, S.Ogo, Y.Watanabe, S Fukuzumi: "Characterization of Imidazolate-Bridged Dinuclear and Mononuclear Hydroperoxo Complexes"Inorg.Chem.. 40. 3200-3207 (2001)
• [文献書誌] N.Haruta, M.Aki, S.Ozaki, Y.Watanabe, T.Kitagawa: "Protein Conformation Change of Myoglobin upon Ligand Binding Probed by Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy"Biochemistry. 40. 6956-6963 (2001)
• [文献書誌] S.Herold, T.Matsui, Y.Watanabe Peroxynitrite Isomerization Catalyzed by His64 Myoglobin Mutants: "Peroxynitrite Isomerization Catalyzed by His64 Myoglobin Mutants"J.Am.Chem.Soc.. 123. 4085-4086 (2001)
• [文献書誌] T.Tomita, S.Ogo, T.Egawa, H.Shimada, N.Okamoto, Y.Imai, Y.Watanabe, Y.Ishimura, T.Kitagawa: "Elucidation of the Differences between the 430 and 455-nm Absorbing Forms of P450-Isocyanide Adducts by Resonance Raman Spectroscopy"J.Biol.Chem. 276. 36261-36267 (2001)
• [文献書誌] I.Hara, T.Ueno, S.Ozaki, S.Itoh, K.Lee, N.Ueyama, Y.Watanabe: "Oxidative Modification of Tryptophan-43 in the Heme Vicinity of the F43W/H64L Myoglobin Mutant"J.Biol.Chem. 276. 36067-36070 (2001)
• [文献書誌] Y.Watanabe: "Asymmetric Oxidation of Sulfides and olefins by Myoglobin Mutants"Coordination Chem.Rev.,. 198. 39-59 (2001)
• [文献書誌] L.Que, Y.Watanabe: "Oxygenase Pathways : Oxo, Peroxo, and Superoxo"Science. 292. 651-653 (2001)
• [文献書誌] S.Ozaki, M.P.Roach, T.Matsui, Y.Watanabe: "Investigations of the Roles of the Distal Heme Environment and the Proximal Heme Iron Ligand in Peroxide Activation by Heme Enzymes via Molecular Engineering of Myoglobin"Acc.Chem.Res.. 34. 818-825 (2001)