| 研究課題/領域番号 |
11228208
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
理工系
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| 研究機関 | 名古屋大学 (2002-2003)
岡崎国立共同研究機構 (1999-2001) |
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研究代表者 |
渡辺 芳人 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (10201245)
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| 研究分担者 |
小崎 紳一 山口大学, 農学部, 助教授 (40280581)
小江 誠司 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (60290904)
上野 隆史 名古屋大学, 物質科学国際研究センター, 助手 (70332179)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2002
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| キーワード | ミオグロビン / 水酸化反応 / シトクロームP450 |
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| 研究概要 |
高難度酸化反応である芳香環の水酸化反応をミオグロビンミュータント/過酸化水素系で達成するために、以下の仕掛を施したミオグロビンミュータントを作成した。
1)基質であるトリプトファンを43位のフェニルアラニンの位置に導入,2)過酸化水素と効率的に反応を進行させるために、64位のヒスチジンをアスパラギン酸へと変換し為さらに、68位のバリンはイソロイシンに置き換えている。
作成したミオグロビシミュータント、F43W/H64D/V68I Mb、と過酸化水素の反応をESI-TOF Massを用いて追跡した結果、一当量の過酸化スイスを加えた段階でミオグロビンの分子量がほぼ定量的に16Da増加していることが明かとなった。さらに過酸化水素を加えると32Daの増加が確認された。
トリプシンによるミオグロビンの分解と、液体クロマトによる修飾部位を含むフラグメントの単離精製を行い、MALDI-TOF Massおよび高分解能NMRによって構造決定を行った。その結果、16Da増加したミオグロビンは、43位に導入したトリプトファンの6位が選択的に水酸化されていることが明らかになった。一方、32Da増加したミオグロビンは、トリプトファンの2,6位にカルボニル基が導入されていることが確認された。
18酸素で標識した過酸化水素を用いることで水酸化反応機構を検討した結果、酸化の第一段階はトリプトファンの6,7位のエポキシ化が進行し、続いて加水分解、芳香化反応によって水酸化物が生成することが確認された。
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