メダカ属における生殖隔離の分子機構:種間雑種の胚発生異常と不妊の分子細胞学的解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11236201
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 山下 正兼 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (30202378)
• キーワード: 遺伝子組み換え / 種間雑種 / 生殖隔離 / 生殖細胞形成 / 胚発生異常 / 不妊 / MPF / メダカ

研究概要

本研究は雑種の発生異常と不妊の原因分子を特定することで、生殖隔離を保証する分子基盤を明らかにすることを目的に、以下の3点について調べた。
1.メダカ種間雑種における肺発生異常の分子基盤
中期胞胚以降の雑種胚発生異常が、細胞分裂の主要調節因子であるMPFの機能不全に因るか否かを調べるため、ニホン・ハイナン・ジャワ・フィリピンメダカからMPFの構成成分であるCdc2とサイクリンB(B1とB2の2種)のcDNAクローンを単離し、全塩基配列を決定した。これらをプローブに、父性サイクリンBmRNAの発現が中期胞胚で開始することを確認した。また、異種のCdc2とサイクリンBで構成されたMPFのキナーゼ活性を調べるため、得られたcDNAクローンをバキュロウイルスで発現させた。試験管内で再構築したニホン・フィリピンメダカ雑種MPFのキナーゼ活性は、内在基質(卵抽出物)に対して、野生型MPFと異なるリン酸化活性を示した。このことは雑種胚の発生異常にMPFの基質特異性が関わる可能性を示す。
2.メダカ種間雑種における生殖細胞形成異常による不妊の分子機構
ニホン・ハイナンメダカ雑種における生殖細胞形成異常の原因遺伝子を探るため、サブトラクション法を用いて雑種あるいは野生種でのみ発現するクローンを単離した。また、雑種における倍数性生殖細胞の形成は、細胞分裂周期におけるチェックポイント機構と関係すると推測されるので、チェックポイントに関わる遺伝子、Mad2、Seculin、Smc3、Rad21のメダカホモログを単離し、組み換え蛋白質を大腸菌で発現し、これらを抗原に抗体を作製した。
3.ゲノム再編機構の実験的検証をめざした基礎技術開発
試験管内で作製した遺伝子導入精子によるトランスジェニックメダカの作製をめざし、まず、精母細胞への遺伝子導入を試みた。メダカペプチド鎖伸長因子プロモーター付、vasaプロモーター付、及びCMVプロモーター付GFPを、エレクトロポレーション法とパーティクルデリバリー法で精巣細胞に導入した。

研究成果

• [文献書誌] Koichi Mita: "Differential expression of cyclins B1 and B2 during medaka (Oryzias latipes) spermatogenesis."Zoological Science. 17. 365-374 (2000)
• [文献書誌] Yohei Shimizu: "Requirement or protamine for maintaining nuclear condensation of medaka (Oryzias latipes) spermatozoa shed into water but not for promoting nuclear condensation during spermatogenesis."International Journal of Developmental Biology. 44. 195-199 (2000)
• [文献書誌] Masakane Yamashita: "Toward modeling of a general mechanism of MPF formation during oocyte maturation in vertebrates."Zoological Science. 17. 841-851 (2000)
• [文献書誌] Yohei Shimizu: "Production of diploid eggs through premeiotic endomitosis in the hybrid medaka between Oryzias latipes and O.curvinotus."Zoological Science. 17. 951-958 (2000)
• [文献書誌] Hitoshi Matsui: "Expression of gelatinases A and B in the ovary of the medaka fish Oryzias latipes."European Journal of Biochemistry. 267. 4658-4668 (2000)
• [文献書誌] Hiroko Kajiura-Kobayashi: "The Mos/MAPK pathway is involved in MII-arrest as a CSF but is neither necessary nor sufficient for initiating oocyte maturation in goldfish."Development, Genes and Evolution. 210. 416-425 (2000)