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「効率的な生殖細胞遺伝子導入個体選別法」の開発に用いるメダカvasa遺伝子の発現調節領域の有効性の検討を昨年度に引き続き行った。メダカvasa遺伝子の発現調節領域に制御された緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含むベクター(olvas-GFP)およびメダカβアクチン遺伝子発現調節領域に制御された赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子を含むベクター(b-act-RFP)を同時にメダカ卵に顕微注入し、GFPおよびRFPの発現パターンの解析を試みた。しかし'ながら、発生が進んでもRFPが観察されず、その原因として、使用していたDsRED1がメダカ細胞に毒性を示すことが考えられた。そこで、DsRED1の改変型であるDsRED2のメダカ細胞への毒性を検討した。幸いDsRED2には、現在の所、毒性は観察されいない。これらの結果から、b-act-RFPを改変したb-act-RFP2およびolvas-DsRED2を作成し、olvas-GFPと共にメダカ卵へ顕微注入し、現在GFPおよびRFPの発現パターンの解析を行っている。
また、新たに導入遺伝子の発現におけるポジション効果(染色体上の挿入位置により発現が影響される現象)を排除する方法として、インシュレーターの有効性の検討を始めた。具体的には、メダカ骨格筋アクチン遺伝子発現調節領域に制御されたRFP(DsRED2)と、インシュレーターに挟まれたolvas-GFPを同時にメダカ卵へ注入し、GFPの発現様式を観察した。その結果、インシュレーターを用いることにより、近傍に存在するシスエレメントの影響を排除できることが示唆された。
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