小胞体から核への情報伝達機構と脂質代謝調節

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11237203
• 研究種目: 特定領域研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 佐藤 隆一郎 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (50187259)
• キーワード: SREBP / 転写因子 / 核 / 小胞体

研究概要

リコンビナントSREBP-2(活性型)を調製し、ジギトニン処理をしたHeLa細胞を用いて核輸送実験を行った。SREBP-2は細胞質を加えた条件下で、温度依存的に核へ輸送され、またこの輸送はATPを必要とし、WGA(Wheat Germ Agglutinin)処理により核への輸送は阻害された。
このSREBPの核輸送が、SV40T抗原の核移行シグナル(NLS:Nuclear Localization Signal)を介した輸送機構と同一か否かを明らかにする目的で核移行シグナルを付加したアルブミンを過剰に加え、阻害効果を観察した。核移行シグナルを付加したGFP(Green Fluorescent Protein)の核輸送は過剰量の核移行シグナル付加アルブミンにより阻害されたが、SREBP-2のそれは阻害を受けなかった。さらに、結合実験から、SREBP-2は核移行シグナルと結合するImportin αとは結合しないことが明らかになり、Importinα/βとの複合体を形成して核輸送される核移行シグナル含有蛋白質とは異なる機序で核輸送されることが推察された。
リコンビナントSREBP-2と結合する因子を探索した結果、Importinβが見出されてきた。この結合は、Ran-GTPにより解離し、Ran-GDPにより影響を受けなかった。この知見に基づいて、Importinβ、Ran、NTF2(p10)を添加し、核輸送を観察すると、この3者共存下でSREBP-2は核へ輸送された。SREBP-2のImportinβ結合部位を明らかにするために、部分欠損リコンビナントSREBP-2を作成し、結合実験を行った。その結果、basic-rich領域を欠いたHLH-Zip領域がImportinβと結合することが明らかになった。この領域をGFPと連結した融合蛋白質を調製し、Importinβ、Ran、NTF2(p10)共存下で核輸送実験を行うと、融合蛋白質は核へと輸送され、この部位がImportinβ依存的な核輸送に必須であることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Sato, R.: "Transcriptional Regulation of the ATP Citrate-lyase Gene by Sterol Regulatory Element-binding Proteins"J. Biol. Chem.. 275 (in press). (2000)
• [文献書誌] Mori, M.: "Presence of phospholipid-neutral lipid complex structures in atherosclerotic lesions as detected by a novel monoclonal antibody"J. Biol. Chem. 274. 24828-24837 (1999)
• [文献書誌] Sato, R.: "Sterol regulatory element-binding protein negatively regulates microsomal triglyceride transfer protein gene transcription"J. Biol. Chem.. 274. 24714-24720 (1999)
• [文献書誌] Yamaguchi, M.: "Characterization of cleavage enzymes for sterol regulatory element binding protein in hamster liver microsomes"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 258. 542-547 (1999)
• [文献書誌] Imanaka, T.: "Characterization of the 70-kDa peroxisomal protein, an ATP-biding cassette transporter"J. Biol. Chem.. 274. 11968-11976 (1999)
• [文献書誌] Nagoshi, E.: "Nuclear import of SREBP-2, a basic helix-loop-helix-leucine zipper (bHLH-Zip)-containing transcription factor occurs through direct interaction of importin b with HLH-Zip"Mol. Biol. Cell. 10. 2221-2233 (1999)