| 研究概要 |
培養細胞を用いた実験等から、CRYとPERとの核移行が、転写のフィードバック機構の本体を調節し、時間の決定機構となるという仮説をたて、時計分子の核移行の詳細な分子機構を検討した。CRY2には典型的な核移行シグナルNLSがカルボキシル端側に存在するが、CRY1には定型的NLSが存在しない。CRY1,CRY2をタグ付きGST融合蛋白として大腸菌にて発現、精製した蛋白をMH3T3培養細胞に注入することによりその核移行を検討した。CRY1,CRY2蛋白の細胞質内注入後、両者とも核内への移行がみられたが、WGA, Ran-GTP, G19V Ran-GTP等との共注入実験を行った所、同じく両者ともRan依存性に核移行することが明らかになった。さらに、CRY1,CRY2をそれぞれN末側C末側に二分割したCRY1N, CRY1C, CRY2N, CRY2Cを、同様に大腸菌を用いて蛋白を発現、精製し、細胞注入した結果、いずれもN末端側蛋白(CRY1N, CRY2N)は核移行を示さず、C端側(CRY1C, CRY2C)は核移行を観察した。セミインタクト細胞を用いたin vitro系では、CRY1C, CRY2Cともにimportinαβを介する核移行を行っていることが示された。NLS配列をもつCRY2Cの核移行はin vitro結合実験の結果からもimportinαβを介する核移行であることを明らかにした。さらに、CRY2のNLSの変異体では核移行が阻害されたことから、CRY2の核移行に必須であることを明らかにした。
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