バラ科植物における配偶体型自家不和合性の分子機構

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11238204
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 乗岡 茂巳 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教授 (70198638)
• キーワード: 自家不和合性 / S-RNase / リボヌクレアーゼ / 自他認識 / ニホンナシ / バラ科 / 立体構造 / 蛋白質間相互作用

研究概要

(1)S-RNaseの立体構造解析
S_3-RNaseの結晶化条件を参考に600通り以上の条件でS_3-RNaseと95.5%のアミノ酸配列の相同性をもつS_5-RNaseの結晶化を試みたが、S_5-RNaseの結晶は得られなかった。
(2)花粉側S遺伝子産物の探索
(i)花粉側和合性変異種の発現タンパク質の解析
中国ナシ不和合性種とその和合性変異種の花粉(管)で発現している蛋白質を二次元電気泳動で分析したが、両品種間で顕著に泳動位置が変化したり、片方の品種で欠損している蛋白質は検出されなかった。
(ii)抗体による花粉側因子の探索
S_3-RNaseのHV領域とC末端領域(立体構造上、ともに分子表面に露出している)をそれぞれ認識するポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体(エピトープは調査中)を作製し、これらの抗体を用いてS_3-RNaseと相互作用する因子を検討したが、そのような因子は検出されなかった。
(3)In vitro花粉管伸長阻害実験系によるS-RNaseの挙動解析
ニホンナシ花粉を液体培地中で花粉管を発芽させた後、培地にS-RNaseを添加して花粉管伸長を観察した。この結果、S-RNaseの濃度が1.6mg/ml以上あれば、花粉管伸長阻害が起ることが判明した。次に、確立したin vitro花粉管伸長阻害実験系を用いて花粉管伸長阻害時におけるS-RNaseの動態を追跡した。S_3-RNaseは花粉管の細胞壁にかなりの量が吸着し、また花粉管内にも侵入し、その局在は花粉管内全体に及んでいた。この結果は、Luuらがイムノゴールド法によりS-RNaseが花粉管のチップ部分に蓄積されるとした報告と若干異なっている。

研究成果

• [文献書誌] Carlos Castillo et al.: "Reconsidreration of S-genotype assignment, discovery of a new allele based on S-RNase PCR-RFLPs in Japanese pear cultivars"Breeding Science. 51. 5-11 (2001)
• [文献書誌] Naoko Norioka et al.: "Sequence comparison of the 5' flanking regions of Pyrus prifolia S-RNases associated with gametophytic self-incompatibility"Sexual Plant Reproduction. 13. 289-291 (2001)
• [文献書誌] Takanori Matsuura et al.: "Crystal structure at 1.5Å resolution of Pyrus pyrifolia ribonuctease responsible for gametophytic self-incompatibility"Journal of Biological Chemistry. 276. 45261-45269 (2001)
• [文献書誌] Koh Ida et al.: "The 1.55Å resolution structure of Nicotiana alata S_<F11>-RNase associated with gametophytic self-incompatibility"Journal of Molecular Biology. 314. 103-112 (2001)
• [文献書誌] Carlos Castillo et al.: "Cloning of the S_8-RNase (S_8-ailele) of Japanese pear (Phrus pyrifolia Nakai)"Plant Biotechnology. 19. 1-6 (2002)