真核生物染色体のS期に於ける動態の全て―出芽酵母第六染色体をモデルとして

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11239205
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 白髭 克彦 独立行政法人理化学研究所, ゲノム情報比較解析研究チーム, 上級研究員 (90273854)
• 研究分担者: 野口 英樹 独立行政法人理化学研究所, ゲノム情報比較解析研究チーム, 研究員 (50333349) ; 坂東 優篤 独立行政法人理化学研究所, ゲノム情報比較解析研究チーム, リサーチアソシエイト (90360627)
• キーワード: 染色体複製 / 複製チェックポイント / 複製停止 / TOF1 / MRC1 / DNAチップ

研究概要

複製チェックポイント制御機構が欠損すると、DNA損傷を修復しないまま、あるいは未複製の染色体を持ったまま、細胞は分裂してしまうため、細胞は死滅あるいは、異常染色体を持ったまま増殖を続けることになる。我々は、チェックポイント制御と複製過程の連携を明らかにするためには一本の染色体のレベルで詳細に複製中の染色体の動態を解析しなくてはならないと考え、出芽酵母第六染色体を解析対象とし、六番染色体全体(280kb)を約13000個の25塩基長の単鎖DNAで余すところなくカバーするカスタムDNAチップを作成した。このDNAチップを用い、いくつかのタンパクの結合領域についてChIP-chip法(Chromatin Immuno-precipitationにより得られたDNAをDNAchip上で検出する方法)により解析を行ったところ1解像度300塩基対でタンパクの結合プロファイルを解析可能であった。同時に我々は複製領域をBrdUでラベルし、抗BrdU抗体で免疫沈降することで検出することにも成功した。
この方法により、チェックポイント非活性化時、HU(ヒドロキシウレア)添加による複製異常時(チェックポイント活性化時)のチェック因子及び複製因子の配置を解析した。その結果、MRC1、及びTOF1という二つのチェックポイント因子のみは異常の有無に関係なく、複製伸長複合体の一部として機能していることが明らかになった。さらに、MRC1とTOF1、それぞれの因子の欠失酵母を用い、HU添加時の複製領域と複製伸長因子の相対的配置を解析した。その結果、変異株中では複製伸長因子が複製領域より新鎖合成を行うことなく2-3kb先行して停止することが判明した。このことは、複製の停止はチェックポイント活性化を必要とせず、複製伸長複合体に組込まれたチェック因子により誘導されることを示している。

研究成果

• [文献書誌] Katou Y, Kanoh Y, Bando M, Noguchi H, Tanaka H, Ashikari T, Sugimoto K, Shirahige K: "S-phase checkpoint proteins Tof1 and Mrc1 form a stable replication-pausing complex."nature. 424. 1078-1083 (2003)
• [文献書誌] Marin A, Gallardo M, Kato Y, Shirahige K, Gutierrez G, Ohta K, Aguilera A.: "Relationship between G+C content, ORF-length and mRNA concentration in Saccharomyces cerevisiae."YEAST. 20. 703-711 (2003)
• [文献書誌] Ohkuni K, Shirahige K, Kikuchi A.: "Genome-wide expression analysis of NAP1 in Saccharomyces cerevisiae."Biochem Biophys Res Commun.. 306. 5-9 (2003)