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細胞増殖に必須であり、複製の進行をモニターして細胞周期を制御するチェックポイント機構にも関わることが示唆されている出芽酵母DNAポリメラーゼε(Polε)の生化学的機能を明らかにし、細胞内でのPolεの固有の役割を明らかにすることが本研究の目的である。平成13年度はPolε見出されたニック本鎖DNA結合能の役割を理解することを目的として以下のことを行った。
1.PolεのアクセサリーサブユニットであるDpb3およびDpb4蛋白質の多量生産と精製
大腸菌の蛋白質多量生産系を用いて、GST融合Dpb4蛋白質および、Dpb3蛋白質の多量生産株を作製した。GST-Dpb4とDpb3の共発現による精製により、Dpb3とDpb4は1:1の分子比で複合体を形成することを示した。また、Dpb4の単独精製も行い、これもホモ二量体を形成することが解った。
2.Dpb3-Dpb4複合体のDNA結合能
Dpb3-Dpb4複合体のDNAとの相互作用をゲルシフト法により検討した結果、この複合体は二本鎖DNAに特異的に結合することが明らかになった。この二本鎖DNA結合は塩基配列非特異的な結合である。予想に反してDpb4ホモ二量体にもDNA結合活性が認められたが、これは一本鎖DNAにも二本鎖DNAにもほぼ同等の結合性を示した。
3.Dpb3-Dpb4複合体のヌクレオチドとの相互作用
Dpb3のアミノ酸配列の解析より、この蛋白質はヌクレオチドとの相互作用に必要なアミノ酸配列に類似する配列を持つことが解っている。そこで、Dpb3-Dpb4複合体のATP結合能およびATPase活性を調べた。しかしながら、いずれの活性も検出されなかった。
4.変異型Dpb3-Dpb4複合体の作製
Dpb3とDpb4の複合体形成能は保持しているものの、二本鎖DNA結合活性のみを失ったような、変異型Dpb3-Dpb4複合体の作製も進行中である。現在までに、変異を持つ複合体の精製まで終了している。今後DNA結合活性を調べる予定である。
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