サイトカインシグナル伝達経路の可視化

1999 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242205
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 安川 秀雄 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (60289361)
• 研究分担者: 神薗 慎太郎 久留米大学, 医学部, 助手 (30261077) ; 大坪 素秋 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (10211799) ; 吉村 昭彦 久留米大学, 分子生命科学研究所, 教授 (90182815) ; 箕口 滋 大阪大学, 大学院・医学系研究科学術振興会, 特別研究員
• キーワード: JAK / GFP / FRET / 1分子 / イメージング / p21 / アクチン / Ras

研究概要

サイトカインシグナルを可視化するためにGFP標識したチロシンキナーゼ(JAK2)、基質となる転写因子STAT、阻害因子JAB、Cblなどを調整し、生きた細胞で観察を行った。現在までのところサイトカインの刺激による受容体とJAKの会合やSTATのダイマー化を可視化するには至っていない。これは発現量の問題、蛍光エネルギー移動(FRET)の効率の問題、検出する顕微鏡システムの問題が考えられ今後解決していきたい。またGFP標識分子を過剰発現しているためか、現実には起こっているはずの反応を追尾できない。発現させた分子のうち数パーセントしか反応に寄与しないとなるとこれを細胞全体のレベルで可視化することは難しいと思われる。この問題は発現量や刺激の強さなどの条件検討によって解決するしかないと思われる。また効率のよい反応系に対象を変更することも考える。
またシグナルのアウトプットとしてチロシンりん酸化をうけるSTAP、サイクリンE、cdk阻害因子p21の結合分子Cizlを新たにクローニングし、標識を行い細胞内局在の可視化を行った。特にCizはp21の核外移行を促進することを見い出した。また最近クローニングに成功したRas-Raf-MAPキナーゼ系やアクチン重合に関与する膜局在分子WARSについてその機能解析を行っており、特にRas-Raf相互作用の一分子イメージングを使ってその作用機序を明らかにしたい。またアポトーシス反応を可視化するためにチトクロームCのGFP標識を行いミトコンドリアに局在することを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Marine JC,et al.: "SOCS3 Is Essential in the Regulation of Fetal Liver Erythropoiesis"Cell. 98・5. 617-627 (1999)
• [文献書誌] Sasaki A,et al.: "Cytokine-inducible SH2 protein-3(CIS3/SOCS3)inhibits Janus tyrosine kinese by binding through the N-terminal kinase inhibitory region as well as SH2 domain"Genes to Cells. 4・6. 339-351 (1999)
• [文献書誌] Yasukawa H,et al.: "The JAK-Binding Protein JAB inhibits Janus Tyrosine Kinase Activity Through Binding in the Activation Loop"EMBO J.. 18・5. 1309-1320 (1999)
• [文献書誌] Yokouchi M,et al.: "APS,an aduptor protein containing PH and SH2 domains,is associated with the PDGF receptor and c-Cbl and inhibits PDGF-induced mitogenesis"Oncogene. 18・3. 759-767 (1999)
• [文献書誌] Sako Y,et al.: "Single-molecule imaging of EGFR on the surface of living cells"Nat.Cell Biol.. 2・3. 168-172 (2000)
• [文献書誌] Minoguchi S,et al.: "Studies on the cell-type specific expression of RBP-L,a RBP-J familly member,by replacement insertion of beta-galactosidase"J.Biochem.(Tokyo). 126・4. 738-747 (1999)