サイトカインシグナル伝達経路の可視化

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 11242205
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 箕口 滋 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (60322757)
• 研究分担者: 神薗 慎太郎 久留米大学, 医学部, 助手 (30261077) ; 脇岡 徹 久留米大学, 分子生命科学研究所, 助手 (40330873) ; 吉村 昭彦 久留米大学, 分子生命科学研究所, 教授 (90182815)
• キーワード: チロシンキナーゼ / サイトカイン / Ras / Raf / 蛍光顕微鏡 / 一分子観察 / EGF受容体 / 細胞内局在

研究概要

本年度はEGF受容体からのシグナル伝達の可視化に取り組んだ。まず活性化型EGF受容体を蛍光ラベルしたEGFもしくは抗リン酸EGF受容体抗体で標識し、全反射を用いたエバネッセント照明法蛍光顕微鏡によって一分子レベルで観察した。その結果EGF受容体はEGF結合によって2量体化するが活性化はEGFが結合しない受容体にまで波及することが明かとなった。次にEGF刺激によって活性化されるRasの動きを一分子観察した。RasはN末端側にEGFPを付加した融合分子として発現させた。刺激に応じてRasの膜上での動きが一過性に制限される様子が観察された。現在統計的な解析を行っている。次にRasによって活性化されるRafの動きを可視化した。まずGFPをN末端側に融合した分子を作成し、野生型Rasとともに293細胞にトランスフェクションした。Time-Lapse蛍光顕微鏡を用いてRafの細胞内局在の変化を経時的に観察した。その結果EGF刺激に応じてRafは細胞膜へ一過性に移動した。その動きはRasの活性化の時間経過とほぼ一致した。この系を用いて我々が新たなチロシンキナーゼの基質としてクローニングしたSPREDの影響を観察した。我々はSPREDはRasおよびRafに会合してRafの活性化を抑制する性質があることを生化学的に明らかにしている。SPREDはRasの活性化は抑制しない。むしろRafの細胞膜への局在を固定する傾向がみられた。このことはRas-Raf-SPREDの複合体が膜上で安定に存在することを示唆するもので、抑制の分子機構を解明する上で重要な情報となるものと思われる。このシステムがEGF受容体からのシグナル伝達の分子機構の解明に有用であることが示された。

研究成果

• [文献書誌] Suzuki A, et al.: "CIS3/SOCS3/SSI3 Plays a Negative Regulatory Role in STAT3 Activation and Intestinal Inflammation."J.Exp.Med.. (in press).
• [文献書誌] Kamizono S, et al.: "The SOCS box of SOCS-1 accelerates ubiquitin-dependent proteolysis of TELJAK2."J.Biol.Chem.. (in press).
• [文献書誌] Sporri B, et al.: "JAB/SOCS1/SSI-1 is an IL-2-induced inhibitor of IL-2 signaling."Blood . 97・1. 221-226 (2001)
• [文献書誌] Sako Y, et al.: "Single-molecule imaging of EGFR on the surface of living cells."Nat.Cell Biol.. 2・3. 168-172 (2000)
• [文献書誌] Sasaki A, et al.: "CIS3/SOCS3 suppresses erythropoietin signaling by binding the EPO receptor and JAK2."J.Biol.Chem.. 275・38. 29338-29347 (2000)
• [文献書誌] Masuhara M, et al.: "Molecular cloning of murine STAP-1, the stem cell-specific adaptor protein containing PH and SH2 domains."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 268・3. 697-703 (2000)